Xử lý cỏc mẫu nghiờn cứu theo phương phỏp đó xõy dựng, tiến hành sắc ký cỏc dung dịch thu được theo điều kiện đó khảo sỏt, thẩm định phương phỏp dựa trờn cỏc chỉ tiờu: tớnh phự hợp của hệ thống, tớnh chọn lọc, độ tuyến tớnh, độ đỳng và độ chớnh xỏc, giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng [21].
Tớnh thớch hợp của hệ thống: Đỏnh giỏ độ ổn định của hệ thống về thời gian lưu và diện tớch pic khi tiờm lặp lại 1 mẫu chuẩn 6 lần liờn tiếp.
Yờu cầu: RSD về thời gian lưu và diện tớch pic < 2%; độ phõn giải của pic CFM và chuẩn nội > 1,5. Sốđĩa lý thuyết của CFM > 5000.
Độ đặc hiệu: Trờn sắc ký đồ, mẫu trắng phải khụng xuất hiện pic cú thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu chuẩn nội; nếu cú
đỏp ứng pic phải < 1% so với nồng độ giữa của khoảng tuyến tớnh.
Độ tuyến tớnh: Đỏp ứng phõn tớch thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phõn tớch trong mẫu thử.
Xõy dựng đường chuẩn ớt nhất 6 điểm (X1 đến Xn) của dung dịch cú chứa chất chuẩn CFM ở trong khoảng nồng độ phự hợp và chất chuẩn nội ở một nồng
độ xỏc định.
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đó chọn. Tiờm 3 lần mỗi mẫu. Tớnh giỏ trị
trung bỡnh.
Xõy dựng phương trỡnh hồi quy tuyến tớnh và tớnh hệ số tương quan r giữa nồng độ CFM và tỷ lệ giữa diện tớch pớc của CFM và diện tớch pớc của chuẩn nội.
Yờu cầu: r > 0,997
Độ đỳng và độ chớnh xỏc: Độ đỳng là sự đồng nhất giữa giỏ trị tỡm thấy với giỏ trị thực hoặc giỏ trị đối chiếu được chấp nhận. Độ chớnh xỏc là sự thống nhất (mức độ phõn tỏn) kết quả giữa một loạt phộp đo từ nhiều lần tiến hành phõn tớch trờn cựng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mụ tả. Độ
chớnh xỏc cú thể chia làm 3 cấp độ: Độ lặp lại, độ chớnh xỏc trung gian và độ tỏi lặp. Chỳng tụi tiến hành khảo sỏt độ lặp lại và độ chớnh xỏc trung gian.
Độđỳng của phương phỏp được tiến hành theo quy trỡnh phõn tớch trờn mẫu tự tạo chứa lượng hoạt chất đó biết trước hàm lượng. Tiến hành trờn 3 điểm nồng
độ: LQC (bằng khoảng 2 - 3 lần LLOQ), MQC (khoảng 40 - 60% ULOQ) và HQC (khoảng 80 - 90% ULOQ). Tại mỗi mức nồng độ phõn tớch 6 mẫu độc lập. Tớnh RSD để xỏc định độ lặp lại của phương phỏp. Tớnh tỉ lệ chuẩn thu hồi lại
được và lượng chuẩn thờm vào để cú được độ đỳng của phương phỏp. Tiến hành lặp lại quy trỡnh trờn vào một ngày khỏc. Tại mỗi nồng độ, xỏc định giỏ trị RSD của 12 mẫu độc lập để xỏc định độ chớnh xỏc trung gian của phương phỏp.
Yờu cầu: Theo AOAC [28]:
- Nồng độ từ 100 – 1000 ng/ml: độ thu hồi từ 80 – 110 %, RSD ≤ 15%. - Nồng độ từ 10 – 100 ng/ml: độ thu hồi từ 60 – 115 %, RSD ≤ 21%.
Khảo sỏt giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng
- Giới hạn phỏt hiện (LOD) của CFM được xỏc định dựa vào hệ số gúc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của đỏp ứng.
Dựa vào độ lệch chuẩn của đỏp ứng và độ dốc: giới hạn phỏt hiện được tớnh theo cụng thức sau:
3,3 Sc
LOD ---
a
Trong đó: SC là độ lệch chuẩn của đáp ứng intercept
a là độ dốc của đ-ờng chuẩn: Y = aX + b
- Giới hạn định lượng (LOQ) được tớnh bằng 3,3 lần giới hạn phỏt hiện.