Cỏc húa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiờn cứu : Cỏc chất chuẩn:
- Cefixim: Chuẩn quốc gia, SKS: 0105192, hàm lượng 98,88%, độ ẩm 10,57%, nơi sản xuất Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.
- Cefdinir (chuẩn làm việc): hàm lượng 99,6%, độ ẩm 2,42%. - Cefuroxim natri, cefadroxil, cefoperazon: chuẩn làm việc. Thuốc thử, dung mụi sử dụng trong nghiờn cứu như sau:
- Dicloromethan, cloroform, diethyl ether, cyclohexan, acid phosphoric
đậm đặc, natri dihydrophosphat, acid hydroclorid đậm đặc loại PA, nơi sản xuất Merck, Đức.
- Giấy thử pH, nơi sản xuất Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.
a. Hệ thống HPLC Merck - Hitachi b. Một số chất chuẩn – húa chất
c. Mẫu nước thải của nhà mỏy Mediplantex Hỡnh 2.1. Húa chất, thuốc thử, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ
2.2.2. Thiết bị - dụng cụ
Cỏc thiết bị, dụng cụ tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (được chuẩn theo ISO/IEC 17025 và GLP ) gồm cú :
- Cõn phõn tớch Sartorius CP 224S (d = 0,01 mg, e = 0,1 mg) (Thụy Sĩ) - Mỏy li tõm Hettich zentrifugen (Đức)
- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Merck – Hitachi với detector DAD, phần mềm Multi-system manager, Interface D7000, Nhật Bản
- Dụng cụ thủy tinh cỏc loại.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.3.1. Khảo sỏt phương phỏp xử lý mẫu 2.3.1. Khảo sỏt phương phỏp xử lý mẫu
- Mục đớch : tỡm được loại dung mụi, tỉ lệ dung mụi xử lý mẫu cú tỷ lệ thu hồi cao, loại được nhiều tạp chất.
- Tiến hành xử lý mẫu thử chứa CFM bằng cỏc cỏch khỏc nhau. Định lượng hoạt chất theo quy trỡnh đó lựa chọn. Đỏnh giỏ và tỡm ra cỏch xử lý phự hợp.
2.3.2. Xõy dựng điều kiện sắc ký
Nghiờn cứu tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sỏt lựa chọn chuẩn nội và cỏc điều kiện sắc ký về cột sắc ký, thành phần và tốc độ pha động, thể tớch tiờm mẫu trờn thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD nhằm lựa chọn
được điều kiện sắc ký phự hợp nhất để xỏc định dư lượng khỏng sinh CFM cú trong nước thải (pic đẹp, tỏch được một số cephalosporin khỏc, LOD đạt yờu cầu).
2.3.3. Đỏnh giỏ phương phỏp
Xử lý cỏc mẫu nghiờn cứu theo phương phỏp đó xõy dựng, tiến hành sắc ký cỏc dung dịch thu được theo điều kiện đó khảo sỏt, thẩm định phương phỏp dựa trờn cỏc chỉ tiờu: tớnh phự hợp của hệ thống, tớnh chọn lọc, độ tuyến tớnh, độ đỳng và độ chớnh xỏc, giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng [21].
Tớnh thớch hợp của hệ thống: Đỏnh giỏ độ ổn định của hệ thống về thời gian lưu và diện tớch pic khi tiờm lặp lại 1 mẫu chuẩn 6 lần liờn tiếp.
Yờu cầu: RSD về thời gian lưu và diện tớch pic < 2%; độ phõn giải của pic CFM và chuẩn nội > 1,5. Sốđĩa lý thuyết của CFM > 5000.
Độ đặc hiệu: Trờn sắc ký đồ, mẫu trắng phải khụng xuất hiện pic cú thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu chuẩn nội; nếu cú
đỏp ứng pic phải < 1% so với nồng độ giữa của khoảng tuyến tớnh.
Độ tuyến tớnh: Đỏp ứng phõn tớch thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phõn tớch trong mẫu thử.
Xõy dựng đường chuẩn ớt nhất 6 điểm (X1 đến Xn) của dung dịch cú chứa chất chuẩn CFM ở trong khoảng nồng độ phự hợp và chất chuẩn nội ở một nồng
độ xỏc định.
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đó chọn. Tiờm 3 lần mỗi mẫu. Tớnh giỏ trị
trung bỡnh.
Xõy dựng phương trỡnh hồi quy tuyến tớnh và tớnh hệ số tương quan r giữa nồng độ CFM và tỷ lệ giữa diện tớch pớc của CFM và diện tớch pớc của chuẩn nội.
Yờu cầu: r > 0,997
Độ đỳng và độ chớnh xỏc: Độ đỳng là sự đồng nhất giữa giỏ trị tỡm thấy với giỏ trị thực hoặc giỏ trị đối chiếu được chấp nhận. Độ chớnh xỏc là sự thống nhất (mức độ phõn tỏn) kết quả giữa một loạt phộp đo từ nhiều lần tiến hành phõn tớch trờn cựng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mụ tả. Độ
chớnh xỏc cú thể chia làm 3 cấp độ: Độ lặp lại, độ chớnh xỏc trung gian và độ tỏi lặp. Chỳng tụi tiến hành khảo sỏt độ lặp lại và độ chớnh xỏc trung gian.
Độđỳng của phương phỏp được tiến hành theo quy trỡnh phõn tớch trờn mẫu tự tạo chứa lượng hoạt chất đó biết trước hàm lượng. Tiến hành trờn 3 điểm nồng
độ: LQC (bằng khoảng 2 - 3 lần LLOQ), MQC (khoảng 40 - 60% ULOQ) và HQC (khoảng 80 - 90% ULOQ). Tại mỗi mức nồng độ phõn tớch 6 mẫu độc lập. Tớnh RSD để xỏc định độ lặp lại của phương phỏp. Tớnh tỉ lệ chuẩn thu hồi lại
được và lượng chuẩn thờm vào để cú được độ đỳng của phương phỏp. Tiến hành lặp lại quy trỡnh trờn vào một ngày khỏc. Tại mỗi nồng độ, xỏc định giỏ trị RSD của 12 mẫu độc lập để xỏc định độ chớnh xỏc trung gian của phương phỏp.
Yờu cầu: Theo AOAC [28]:
- Nồng độ từ 100 – 1000 ng/ml: độ thu hồi từ 80 – 110 %, RSD ≤ 15%. - Nồng độ từ 10 – 100 ng/ml: độ thu hồi từ 60 – 115 %, RSD ≤ 21%.
Khảo sỏt giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng
- Giới hạn phỏt hiện (LOD) của CFM được xỏc định dựa vào hệ số gúc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của đỏp ứng.
Dựa vào độ lệch chuẩn của đỏp ứng và độ dốc: giới hạn phỏt hiện được tớnh theo cụng thức sau:
3,3 Sc
LOD ---
a
Trong đó: SC là độ lệch chuẩn của đáp ứng intercept
a là độ dốc của đ-ờng chuẩn: Y = aX + b
- Giới hạn định lượng (LOQ) được tớnh bằng 3,3 lần giới hạn phỏt hiện.
2.3.4. Phương phỏp xử lý số liệu
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU 3.1. XÂY DỰNG QUY TRèNH PHÂN TÍCH 3.1.1. Khảo sỏt phương phỏp xử lý mẫu
Qua tham khảo tài liệu, cefixim cú giỏ trị log Poctanol/nước = -0,64 nờn việc chuyển CFM từ pha nước (nước thải) sang pha dung mụi là khỏ khú khăn. Chỳng tụi tiến hành xử lý mẫu với mục đớch loại tạp chất tan trong dung mụi hữu cơ, CFM vẫn ở trong pha nước. Cụ thể, chỳng tụi sẽ tiến hành khảo sỏt để lựa chọn dung mụi xử lý mẫu, lượng dung mụi và điều kiện xử lý phự hợp để tỡm ra quy trỡnh xử lý mẫu sạch nhất, tỷ lệ thu hồi cao, dễ thực hiện. Kết quả khảo sỏt
được đỏnh giỏ qua hiệu suất xử lý mẫu: lượng CFM tớnh được trong mẫu sau xử
lý so sỏnh với lượng CFM thờm vào mẫu nước thải.
3.1.1.1. Khảo sỏt xử lý mẫu cú sử dụng dung mụi acetonitril
Giai đoạn đầu của nghiờn cứu, chỳng tụi khảo sỏt xử lý mẫu nước thải chứa CFM với 3 dung mụi: dicloromethan, diethyl ether, cloroform với cựng tỷ lệ mẫu thử : acetonitril : dung mụi = (5 : 1 : 3).
Chuẩn bị cỏc mẫu chuẩn:
- Dung dịch chuẩn gốc (CFM 50 àg/ml trong nước cất): Cõn chớnh xỏc khoảng 25 mg CFM hũa tan trong vừa đủ 500 ml nước cất.
- Dung dịch chuẩn: pha loóng mẫu chuẩn gốc trong nước cất để được nồng
độ CFM 500 ng/ml.
Tiến hành:
- Lần lượt xử lý mẫu thử với từng dung mụi trong 3 dung mụi dicloromethan, cloroform, diethyl ether.
- Xử lý mẫu: Mẫu tự tạo được acid húa với HCl 1N đến pH khoảng bằng 3, thử bằng giấy chỉ thị màu pH. Lấy chớnh xỏc 5 ml dung dịch thử vào cỏc ống nghiệm, thờm 1 ml acetonitril (ACN), lắc xoỏy trong 30 giõy, đem ly tõm tốc độ
3000 vũng/phỳt trong 3 phỳt, lấy dịch trong nổi phớa trờn. Thờm 3 ml dung mụi chiết lắc trong 5 phỳt, để cho tỏch lớp. Lấy lớp nước (đối với dicloromethan, cloroform lấy dịch phớa trờn, đối với diethyl ether lấy dịch phớa dưới) ly tõm nếu cần, lọc qua màng lọc 0,45 àm.
- Dung dịch chuẩn: mẫu chuẩn được lọc qua màng lọc 0,45 àm . - Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký đó chọn. Kết quả thu được như Hỡnh 3.1 và Bảng 3.1. Bảng 3.1. Khảo sỏt lựa chọn dung mụi xử lý mẫu Dung dịch chuẩn Xử lý bằng Dicloromethan Xử lý bằng Cloroform Xử lý bằng Diethyl ether Spic (mAu.s) 153672 124109 75993 64927 Tỷ lệ thu hồi (%) - 80,76% 49,45% 42,25%
a. Xử lý mẫu với dicloromethan: ACN c. Xử lý mẫu với diethyl ether : ACN b. Xử lý mẫu với cloroform:ACN
Hỡnh 3.1. Sắc ký đồ khảo sỏt lựa chọn dung mụi xử lý mẫu
Nhận xột: Cả 3 dung mụi đều dễ tỏch lớp, khụng bị nhũ húa trong quỏ trỡnh xử
lý mẫu. Quỏ trỡnh xử lý mẫu tương đối dễ dàng và tốn ớt thời gian.Mẫu xử lý với dicloromethan và diethyl ether tương đối sạch. Mẫu xử lý với dicloromethan cho
hiệu suất cao nhất, trong khi mẫu xử lý với cloroform và diethyl ether cho tỷ lệ
thu hồi thấp.
Qua khảo sỏt trờn, chỳng tụi nhận thấy xử lý bằng dicloromethan cho tỷ lệ
thu hồi cao nhất mà nền mẫu vẫn đạt yờu cầu. Do đú, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt tỷ lệ thể tớch của mẫu thử, ACN, dicloromethan để cú thể nõng cao được tỷ lệ
thu hồi.
Chuẩn bị cỏc dung dịch tự tạo và chuẩn như phần 3.1.1.1
Tiến hành :
- Xử lý mẫu thử với tỉ lệ dung mụi dicloromethan khỏc nhau. Chỳng tụi tiến hành khảo sỏt 3 tỉ lệ về thể tớch của mẫu thử, ACN, dicloromethan như sau :
+ Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 : 2) + Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 : 3) + Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 : 4) - Cỏc bước tiến hành như mục 3.1.1.1. - Kết quả thu được nhưở Hỡnh 3.2.
Nhận xột: Với cả 3 tỉ lệ dung mụi xử lý mẫu khỏc nhau, cỏc mẫu đều khụng bị
nhũ húa, dễ dàng tỏch lớp. Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:2), nền mẫu vẫn cũn nhiều tạp chất, tỷ lệ thu hồi thấp. Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:4), nền mẫu sạch tuy nhiờn tỷ lệ thu hồi thấp. Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:3), nền mẫu sạch, tỷ lệ thu hồi đạt 80,76%.
Tuy nhiờn, chiết bằng dicloromethan và ACN với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:3) đỏp ứng phõn tớch vẫn chưa được cao. Chỳng tụi nhận thấy nguyờn nhõn đú là do ACN được cho vào với mục đớch giỳp loại protein, tuy nhiờn chớnh dung mụi này lại làm pha loóng mẫu (do ACN là dung mụi đồng tan với nước), do đú làm giảm đỏng kể đỏp ứng phõn tớch của quỏ trỡnh chiết (dự
a. Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :2) b. Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :3) c. Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :4)
Hỡnh 3.2. Sắc ký đồ khảo sỏt lựa chọn lượng dung mụi xử lý mẫu
3.1.1.2. Khảo sỏt điều kiện xử lý mẫu khụng sử dụng acetonitril
Qua phõn tớch nguyờn nhõn làm giảm hiệu suất của quỏ trỡnh xử lý mẫu trờn, chỳng tụi tiếp tục khảo sỏt điều kiện xử lý mẫu bằng cỏch khụng sử dụng ACN và lựa chọn một dung mụi hoàn toàn khụng đồng tan với nước để xử lý. Trong giai đoạn khảo sỏt điều kiện xử lý mẫu này, chỳng tụi đồng thời khảo sỏt hiệu suất thu hồi 4 cephalosporin khỏc (cefdinir, cefuroxim, cefadroxil và cefoperazon) để cú thể lựa chọn một chuẩn nội phự hợp. Cỏc dung mụi được lựa chọn cho khảo sỏt đú là cloroform (CRF), diethyl ether (DEE) và cyclohexan
(CHX); điều kiện xử lý mẫu hoặc giữ nguyờn hoặc acid húa về pH 3,0; tỷ lệ mẫu thử: dung mụi để khảo sỏt là (4:4) và (5:3).
Quy trỡnh xử lý mẫu như sau: Hỳt mẫu thử và dung mụi với tỷ lệ phự hợp, lắc xoỏy trong vũng 10 phỳt. Ly tõm với tốc độ 3000 vũng/giờ trong 5 phỳt. Sau
đú lấy nước lớp bờn trờn (xử lý mẫu bằng CRF) hoặc lấy lớp nước ở dưới (xử lý mẫu bằng DEE hoặc CHX), lọc qua màng lọc 0,45àm và tiến hành sắc ký theo cỏc điều kiện ở mục 3.1.3 (đối với cefixim, cefdinir, cefuroxim sử dụng bước súng 285 nm để phỏt hiện, đối với cefadroxil và cefoperazon sử dụng bước súng 260 nm để phỏt hiện).
Kết quảđược trỡnh bày theo cỏc bảng và hỡnh sau:
(a) Xử lý với DEE tỷ lệ 5:3 khụng acid húa
(b) Xử lý với DEE tỷ lệ 4:4 khụng acid húa
(c) Xử lý với DEE tỷ lệ 5:3 acid húa (d) Xử lý với DEE tỷ lệ 4:4 acid húa Hỡnh 3.3. Sắc ký đồ khảo sỏt quỏ trỡnh xử lý mẫu với diethyl ether
Bảng 3.2. Khảo sỏt xử lý mẫu với dung mụi diethyl ether
Khụng acid hoỏ Acid hoỏ Mẫu thử-DM (4:4) Mẫu th(5:3) ử-DM Mẫu th(4:4) ử-DM Mẫu th(5:3) ử-DM Phương phỏp xử lý Chất tR (phỳt) S H S H S H S H Cefadroxil 5,62 72259 76,1 73924 77,8 89634 94,4 88565 93,3 Cefdinir 8,27 43943 20,1 83020 37,9 168459 77,0 177209 81,0 Cefixim 8,88 134015 70,7 148413 78,3 152506 80,5 158251 83,5 Cefuroxim 9,55 105554 83,7 99968 79,3 82357 74,6 94032 74,6 Cefoperazon 10,0 54419 69,5 58130 74,2 47636 69,1 54102 69,1
S: diện tớch pic (mAU.s) H: Hiệu suất (%)
(a) Xử lý với CRF tỷ lệ 5:3 khụng acid húa
(b) Xử lý với CRF tỷ lệ 4:4 khụng acid húa
(c) Xử lý với CRF tỷ lệ 5:3 acid húa (d) Xử lý với CRF tỷ lệ 4:4 acid húa
Bảng 3.3. Khảo sỏt xử lý mẫu với dung mụi cloroform
Khụng acid hoỏ Acid hoỏ Mẫu thử-DM (4:4) Mẫu th(5:3) ử-DM Mẫu th(4:4) ử-DM Mẫu th(5:3) ử-DM Phương phỏp xử lý Chất tR (phỳt) S H S H S H S H Cefadroxil 5,81 75462 79,5 78738 82,9 95591 100,7 96343 101,4 Cefdinir 8,69 0 0,0 0 0,0 196724 89,9 218952 100,1 Cefixim 9,41 77091 41,1 77547 40,9 178784 95,3 181864 96,8 Cefuroxim 10,42 82450 65,4 84327 66,9 98242 77,9 122075 96,8 Cefoperazon 11,15 44213 56,4 46772 59,7 47850 61,1 74248 94,8
S: diện tớch pic (mAU.s) H: Hiệu suất (%)
(a)Xử lý với CHX tỷ lệ 5:3 khụng acid húa
(b) Xử lý với CHX tỷ lệ 4:4 khụng acid húa
(c) Xử lý với CHX tỷ lệ 5:3 acid húa (d) Xử lý với CHX tỷ lệ 4:4 acid húa
Bảng 3.4. Khảo sỏt xử lý mẫu với dung mụi cyclohexan
Khụng acid hoỏ Acid hoỏ Mẫu thử-DM (4:4) Mẫu thử-DM (5:3) Mẫu thử-DM (4:4) Mẫu thử-DM (5:3) Phương phỏp xử lý Chất tR (phỳt) S H S H S H S H Cefadroxil 5,84 61908 65,2 63232 66,6 76557 80,6 78526 82,7 Cefdinir 8,72 6859 3,1 5896 2,7 92707 42,4 97105 44,4 Cefixim 9,44 33979 18,1 30982 16,5 92118 48,6 89252 47,1 Cefuroxim 10,42 59382 47,1 58107 46,1 67491 53,5 70826 56,2 Cefoperazon 11,15 34894 44,5 33422 42,7 73909 94,4 76113 97,2
S: diện tớch pic (mAU.s) H: Tỷ lệ thu hồi (%)
Nhận xột: Với cả ba dung mụi sử dụng, mẫu thử khụng acid húa trước khi xử lý thỡ tỷ lệ thu hồi thấp hơn khi mẫu thửđược acid húa về pH 3 với tỷ lệ mẫu thử - dung mụi tương ứng. Nền mẫu khi xử lý bằng CRF và DEE là khỏ sạch hơn mẫu xử lý bằng CHX. Khi xử lý mẫu bằng CRF, acid húa trước về khoảng pH 3 với tỷ lệ 5:3 thỡ hiệu suất thu hồi của cả 5 cephalosporin nghiờn cứu thu được cao nhất. Do đú, dựa trờn tiờu chớ về khả năng loại bỏ tạp chất và tỷ lệ thu hồi chỳng tụi lựa chọn điều kiện xử lý mẫu sử dụng CRF, tỷ lệ mẫu thử - dung mụi là 5:3 và mẫu được acid húa trước khi xử lý.
Sau đú, chỳng tụi cũn tiến hành khảo sỏt tiếp với điều kiện như trờn, nhưng giảm tỷ lệ mẫu thử - dung mụi xuống 6:2 với mục tiờu là tỡm lượng tối thiểu dung mụi sử dụng cho tỷ lệ thu hồi cao và nền mẫu vẫn đảm bảo độ phõn giải đường nền. Kết quả sắc ký theo hỡnh sau:
Hỡnh 3.6. Sắc ký đồ khảo sỏt xử lý mẫu bằng cloroform tỷ lệ 6:2 acid húa Kết quả cho thấy nền mẫu khi chiết với tỷ lệ 6:2 cũng khụng thay đổi so với tỷ lệ 5:3, tuy nhiờn hiệu suất thu hồi của CFM thấp hơn (91,2%). Do đú, chỳng tụi lựa chọn quy trỡnh xử lý mẫu cú acid húa và sử dụng CRF với tỷ lệ
mẫu thử: CRF = 5:3 để tiếp tục nghiờn cứu.
Tiếp theo, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt độ ổn định của quy trỡnh xử lý mẫu này, kết quả thu được theo Bảng 3.5.