CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU 3.1. XÂY DỰNG QUY TRèNH PHÂN TÍCH 3.1.1. Khảo sỏt phương phỏp xử lý mẫu
Qua tham khảo tài liệu, cefixim cú giỏ trị log Poctanol/nước = -0,64 nờn việc chuyển CFM từ pha nước (nước thải) sang pha dung mụi là khỏ khú khăn. Chỳng tụi tiến hành xử lý mẫu với mục đớch loại tạp chất tan trong dung mụi hữu cơ, CFM vẫn ở trong pha nước. Cụ thể, chỳng tụi sẽ tiến hành khảo sỏt để lựa chọn dung mụi xử lý mẫu, lượng dung mụi và điều kiện xử lý phự hợp để tỡm ra quy trỡnh xử lý mẫu sạch nhất, tỷ lệ thu hồi cao, dễ thực hiện. Kết quả khảo sỏt
được đỏnh giỏ qua hiệu suất xử lý mẫu: lượng CFM tớnh được trong mẫu sau xử
lý so sỏnh với lượng CFM thờm vào mẫu nước thải.
3.1.1.1. Khảo sỏt xử lý mẫu cú sử dụng dung mụi acetonitril
Giai đoạn đầu của nghiờn cứu, chỳng tụi khảo sỏt xử lý mẫu nước thải chứa CFM với 3 dung mụi: dicloromethan, diethyl ether, cloroform với cựng tỷ lệ mẫu thử : acetonitril : dung mụi = (5 : 1 : 3).
Chuẩn bị cỏc mẫu chuẩn:
- Dung dịch chuẩn gốc (CFM 50 àg/ml trong nước cất): Cõn chớnh xỏc khoảng 25 mg CFM hũa tan trong vừa đủ 500 ml nước cất.
- Dung dịch chuẩn: pha loóng mẫu chuẩn gốc trong nước cất để được nồng
độ CFM 500 ng/ml.
Tiến hành:
- Lần lượt xử lý mẫu thử với từng dung mụi trong 3 dung mụi dicloromethan, cloroform, diethyl ether.
- Xử lý mẫu: Mẫu tự tạo được acid húa với HCl 1N đến pH khoảng bằng 3, thử bằng giấy chỉ thị màu pH. Lấy chớnh xỏc 5 ml dung dịch thử vào cỏc ống nghiệm, thờm 1 ml acetonitril (ACN), lắc xoỏy trong 30 giõy, đem ly tõm tốc độ
3000 vũng/phỳt trong 3 phỳt, lấy dịch trong nổi phớa trờn. Thờm 3 ml dung mụi chiết lắc trong 5 phỳt, để cho tỏch lớp. Lấy lớp nước (đối với dicloromethan, cloroform lấy dịch phớa trờn, đối với diethyl ether lấy dịch phớa dưới) ly tõm nếu cần, lọc qua màng lọc 0,45 àm.
- Dung dịch chuẩn: mẫu chuẩn được lọc qua màng lọc 0,45 àm . - Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký đó chọn. Kết quả thu được như Hỡnh 3.1 và Bảng 3.1. Bảng 3.1. Khảo sỏt lựa chọn dung mụi xử lý mẫu Dung dịch chuẩn Xử lý bằng Dicloromethan Xử lý bằng Cloroform Xử lý bằng Diethyl ether Spic (mAu.s) 153672 124109 75993 64927 Tỷ lệ thu hồi (%) - 80,76% 49,45% 42,25%
a. Xử lý mẫu với dicloromethan: ACN c. Xử lý mẫu với diethyl ether : ACN b. Xử lý mẫu với cloroform:ACN
Hỡnh 3.1. Sắc ký đồ khảo sỏt lựa chọn dung mụi xử lý mẫu
Nhận xột: Cả 3 dung mụi đều dễ tỏch lớp, khụng bị nhũ húa trong quỏ trỡnh xử
lý mẫu. Quỏ trỡnh xử lý mẫu tương đối dễ dàng và tốn ớt thời gian.Mẫu xử lý với dicloromethan và diethyl ether tương đối sạch. Mẫu xử lý với dicloromethan cho
hiệu suất cao nhất, trong khi mẫu xử lý với cloroform và diethyl ether cho tỷ lệ
thu hồi thấp.
Qua khảo sỏt trờn, chỳng tụi nhận thấy xử lý bằng dicloromethan cho tỷ lệ
thu hồi cao nhất mà nền mẫu vẫn đạt yờu cầu. Do đú, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt tỷ lệ thể tớch của mẫu thử, ACN, dicloromethan để cú thể nõng cao được tỷ lệ
thu hồi.
Chuẩn bị cỏc dung dịch tự tạo và chuẩn như phần 3.1.1.1
Tiến hành :
- Xử lý mẫu thử với tỉ lệ dung mụi dicloromethan khỏc nhau. Chỳng tụi tiến hành khảo sỏt 3 tỉ lệ về thể tớch của mẫu thử, ACN, dicloromethan như sau :
+ Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 : 2) + Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 : 3) + Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 : 4) - Cỏc bước tiến hành như mục 3.1.1.1. - Kết quả thu được nhưở Hỡnh 3.2.
Nhận xột: Với cả 3 tỉ lệ dung mụi xử lý mẫu khỏc nhau, cỏc mẫu đều khụng bị
nhũ húa, dễ dàng tỏch lớp. Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:2), nền mẫu vẫn cũn nhiều tạp chất, tỷ lệ thu hồi thấp. Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:4), nền mẫu sạch tuy nhiờn tỷ lệ thu hồi thấp. Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:3), nền mẫu sạch, tỷ lệ thu hồi đạt 80,76%.
Tuy nhiờn, chiết bằng dicloromethan và ACN với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:3) đỏp ứng phõn tớch vẫn chưa được cao. Chỳng tụi nhận thấy nguyờn nhõn đú là do ACN được cho vào với mục đớch giỳp loại protein, tuy nhiờn chớnh dung mụi này lại làm pha loóng mẫu (do ACN là dung mụi đồng tan với nước), do đú làm giảm đỏng kể đỏp ứng phõn tớch của quỏ trỡnh chiết (dự
a. Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :2) b. Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :3) c. Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :4)
Hỡnh 3.2. Sắc ký đồ khảo sỏt lựa chọn lượng dung mụi xử lý mẫu
3.1.1.2. Khảo sỏt điều kiện xử lý mẫu khụng sử dụng acetonitril
Qua phõn tớch nguyờn nhõn làm giảm hiệu suất của quỏ trỡnh xử lý mẫu trờn, chỳng tụi tiếp tục khảo sỏt điều kiện xử lý mẫu bằng cỏch khụng sử dụng ACN và lựa chọn một dung mụi hoàn toàn khụng đồng tan với nước để xử lý. Trong giai đoạn khảo sỏt điều kiện xử lý mẫu này, chỳng tụi đồng thời khảo sỏt hiệu suất thu hồi 4 cephalosporin khỏc (cefdinir, cefuroxim, cefadroxil và cefoperazon) để cú thể lựa chọn một chuẩn nội phự hợp. Cỏc dung mụi được lựa chọn cho khảo sỏt đú là cloroform (CRF), diethyl ether (DEE) và cyclohexan
(CHX); điều kiện xử lý mẫu hoặc giữ nguyờn hoặc acid húa về pH 3,0; tỷ lệ mẫu thử: dung mụi để khảo sỏt là (4:4) và (5:3).
Quy trỡnh xử lý mẫu như sau: Hỳt mẫu thử và dung mụi với tỷ lệ phự hợp, lắc xoỏy trong vũng 10 phỳt. Ly tõm với tốc độ 3000 vũng/giờ trong 5 phỳt. Sau
đú lấy nước lớp bờn trờn (xử lý mẫu bằng CRF) hoặc lấy lớp nước ở dưới (xử lý mẫu bằng DEE hoặc CHX), lọc qua màng lọc 0,45àm và tiến hành sắc ký theo cỏc điều kiện ở mục 3.1.3 (đối với cefixim, cefdinir, cefuroxim sử dụng bước súng 285 nm để phỏt hiện, đối với cefadroxil và cefoperazon sử dụng bước súng 260 nm để phỏt hiện).
Kết quảđược trỡnh bày theo cỏc bảng và hỡnh sau:
(a) Xử lý với DEE tỷ lệ 5:3 khụng acid húa
(b) Xử lý với DEE tỷ lệ 4:4 khụng acid húa
(c) Xử lý với DEE tỷ lệ 5:3 acid húa (d) Xử lý với DEE tỷ lệ 4:4 acid húa Hỡnh 3.3. Sắc ký đồ khảo sỏt quỏ trỡnh xử lý mẫu với diethyl ether
Bảng 3.2. Khảo sỏt xử lý mẫu với dung mụi diethyl ether
Khụng acid hoỏ Acid hoỏ Mẫu thử-DM (4:4) Mẫu th(5:3) ử-DM Mẫu th(4:4) ử-DM Mẫu th(5:3) ử-DM Phương phỏp xử lý Chất tR (phỳt) S H S H S H S H Cefadroxil 5,62 72259 76,1 73924 77,8 89634 94,4 88565 93,3 Cefdinir 8,27 43943 20,1 83020 37,9 168459 77,0 177209 81,0 Cefixim 8,88 134015 70,7 148413 78,3 152506 80,5 158251 83,5 Cefuroxim 9,55 105554 83,7 99968 79,3 82357 74,6 94032 74,6 Cefoperazon 10,0 54419 69,5 58130 74,2 47636 69,1 54102 69,1
S: diện tớch pic (mAU.s) H: Hiệu suất (%)
(a) Xử lý với CRF tỷ lệ 5:3 khụng acid húa
(b) Xử lý với CRF tỷ lệ 4:4 khụng acid húa
(c) Xử lý với CRF tỷ lệ 5:3 acid húa (d) Xử lý với CRF tỷ lệ 4:4 acid húa
Bảng 3.3. Khảo sỏt xử lý mẫu với dung mụi cloroform
Khụng acid hoỏ Acid hoỏ Mẫu thử-DM (4:4) Mẫu th(5:3) ử-DM Mẫu th(4:4) ử-DM Mẫu th(5:3) ử-DM Phương phỏp xử lý Chất tR (phỳt) S H S H S H S H Cefadroxil 5,81 75462 79,5 78738 82,9 95591 100,7 96343 101,4 Cefdinir 8,69 0 0,0 0 0,0 196724 89,9 218952 100,1 Cefixim 9,41 77091 41,1 77547 40,9 178784 95,3 181864 96,8 Cefuroxim 10,42 82450 65,4 84327 66,9 98242 77,9 122075 96,8 Cefoperazon 11,15 44213 56,4 46772 59,7 47850 61,1 74248 94,8
S: diện tớch pic (mAU.s) H: Hiệu suất (%)
(a)Xử lý với CHX tỷ lệ 5:3 khụng acid húa
(b) Xử lý với CHX tỷ lệ 4:4 khụng acid húa
(c) Xử lý với CHX tỷ lệ 5:3 acid húa (d) Xử lý với CHX tỷ lệ 4:4 acid húa
Bảng 3.4. Khảo sỏt xử lý mẫu với dung mụi cyclohexan
Khụng acid hoỏ Acid hoỏ Mẫu thử-DM (4:4) Mẫu thử-DM (5:3) Mẫu thử-DM (4:4) Mẫu thử-DM (5:3) Phương phỏp xử lý Chất tR (phỳt) S H S H S H S H Cefadroxil 5,84 61908 65,2 63232 66,6 76557 80,6 78526 82,7 Cefdinir 8,72 6859 3,1 5896 2,7 92707 42,4 97105 44,4 Cefixim 9,44 33979 18,1 30982 16,5 92118 48,6 89252 47,1 Cefuroxim 10,42 59382 47,1 58107 46,1 67491 53,5 70826 56,2 Cefoperazon 11,15 34894 44,5 33422 42,7 73909 94,4 76113 97,2
S: diện tớch pic (mAU.s) H: Tỷ lệ thu hồi (%)
Nhận xột: Với cả ba dung mụi sử dụng, mẫu thử khụng acid húa trước khi xử lý thỡ tỷ lệ thu hồi thấp hơn khi mẫu thửđược acid húa về pH 3 với tỷ lệ mẫu thử - dung mụi tương ứng. Nền mẫu khi xử lý bằng CRF và DEE là khỏ sạch hơn mẫu xử lý bằng CHX. Khi xử lý mẫu bằng CRF, acid húa trước về khoảng pH 3 với tỷ lệ 5:3 thỡ hiệu suất thu hồi của cả 5 cephalosporin nghiờn cứu thu được cao nhất. Do đú, dựa trờn tiờu chớ về khả năng loại bỏ tạp chất và tỷ lệ thu hồi chỳng tụi lựa chọn điều kiện xử lý mẫu sử dụng CRF, tỷ lệ mẫu thử - dung mụi là 5:3 và mẫu được acid húa trước khi xử lý.
Sau đú, chỳng tụi cũn tiến hành khảo sỏt tiếp với điều kiện như trờn, nhưng giảm tỷ lệ mẫu thử - dung mụi xuống 6:2 với mục tiờu là tỡm lượng tối thiểu dung mụi sử dụng cho tỷ lệ thu hồi cao và nền mẫu vẫn đảm bảo độ phõn giải đường nền. Kết quả sắc ký theo hỡnh sau:
Hỡnh 3.6. Sắc ký đồ khảo sỏt xử lý mẫu bằng cloroform tỷ lệ 6:2 acid húa Kết quả cho thấy nền mẫu khi chiết với tỷ lệ 6:2 cũng khụng thay đổi so với tỷ lệ 5:3, tuy nhiờn hiệu suất thu hồi của CFM thấp hơn (91,2%). Do đú, chỳng tụi lựa chọn quy trỡnh xử lý mẫu cú acid húa và sử dụng CRF với tỷ lệ
mẫu thử: CRF = 5:3 để tiếp tục nghiờn cứu.
Tiếp theo, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt độ ổn định của quy trỡnh xử lý mẫu này, kết quả thu được theo Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khảo sỏt độ ổn định của quỏ trỡnh xử lý mẫu
Tỷ lệ thu hồi (%) STT
Cefadroxil Cefdinir Cefixim Cefuroxim Cefoperazon
1 100,8 100,1 95,9 98,7 93,4 2 102,8 100,6 96,0 98,6 94,0 3 101,9 99,7 95,7 96,9 94,1 4 100,1 100,6 96,3 94,8 93,7 5 100,3 100,7 95,4 96,9 94,1 6 103,3 99,2 97,0 95,8 93,6 TB 101,5 100,2 96,0 96,9 93,8 SD 1,35 0,59 0,55 1,52 0,30 RSD (%) 1,33 0,59 0,57 1,57 0,32
Kết quả cho thấy với quy trỡnh xử lý mẫu sử dụng cloroform, tỷ lệ 5:3 và mẫu thử được acid húa về khoảng pH 3 trước khi xử lý thỡ hiệu suất thu hồi của cả 5 cephalosporin nghiờn cứu đều cao và ổn định (với RSD < 2%). Trong đú tỷ
lệ thu hồi của CFM là 96,0% với RSD = 0,57%, là cao nhất trong cỏc phương phỏp khảo sỏt được. Như vậy, qua quỏ trỡnh khảo sỏt lựa chọn dung mụi, lượng mụi dung xử lý chỳng tụi lựa chọn quy trỡnh xử lý mẫu cụ thể như sau:
“Acid húa mẫu thử bằng HCl 1N đến pH khoảng bằng 3 (thử bằng giấy chỉ
thị màu pH). Lấy chớnh xỏc 5 ml mẫu thử và 3 ml cloroform cho vào ống nghiệm, lắc xoỏy trong 5 phỳt, ly tõm với tốc độ 3000 vũng/phỳt. Lấy lớp nước phớa trờn, lọc qua màng lọc 0,45 àm”.
3.1.2. Khảo sỏt quy trỡnh phõn tớch
Một nhà mỏy sản xuất cephalosporin thường sản xuất đồng thời nhiều cephalosporin, do vậy điều kiện sắc ký đũi hỏi phải định lượng được CFM khi cú mặt cỏc cephalosporin khỏc trong nền mẫu. Chỳng tụi tiến hành khảo sỏt thay
đổi điều kiện sắc ký về cột sắc ký, thành phần và tốc độ pha động, thể tớch tiờm mẫu nhằm tỡm ra điều kiện sắc ký tối ưu nhất cú khả năng tỏch được CFM trong hỗn hợp gồm 4 cephalosporin khỏc: cefadroxil, cefdinir, cefuroxim, cefoperazon.
Tiến hành: pha một hỗn hợp gồm CFM và 4 cephalosporin kể trờn cú nồng
độ 500 ng/ml trong nước, lọc qua màng lọc 0,45 àm và tiến hành sắc ký.
3.1.2.1. Khảo sỏt chương trỡnh pha động và tốc độ dũng
Qua tham khảo tài liệu, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt 2 chương trỡnh pha
động và tốc độ dũng. Cỏc điều kiện sắc ký khỏc như sau: Cột Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; 5 àm), thể tớch tiờm mẫu 200 àl; detector DAD: 285 nm. Chương trỡnh pha động và tốc độ dũng khảo sỏt như sau:
- Chương trỡnh 1: chương trỡnh đẳng dũng pha động
+ Pha động: hỗn hợp ACN : MeOH (50:50) : dung dịch acid trifloroacetic (19:81)
+ Tốc độ dũng: 2 ml/phỳt + Nhiệt độ cột: 50°C
+ Cỏc điều kiện khỏc như mục 3.1.2
- Chương trỡnh 2: chương trỡnh gradient pha động
+ Pha động: methanol – dung dịch đệm phosphat pH = 3,2 ( NaH2PO4 40 mM, chỉnh pH bằng H3PO4)
+ Nhiệt độ cột: 32ºC
+ Pha động và tốc độ dũng: gradient
Thời gian (phỳt) MeOH (%) Dung dịch đệm phosphat (%) Tốc độ dũng (ml/phỳt) 0 18 82 1,0 6 45 55 1,0 13 55 45 0,85 14 18 82 0,85 Kết quả thu được như Hỡnh 3.7.
a. Chương trỡnh đẳng dũng pha động b. Chương trỡnh gradient pha động Hỡnh 3.7. Sắc ký đồ khảo sỏt thành phần pha động và tốc độ dũng
Nhận xột:
- Với chương trỡnh sắc ký đẳng dũng: pic CFM khụng tỏch hoàn toàn khỏi cỏc cephalosporin khỏc và pic bị doóng, khụng cõn xứng.
- Với chương trỡnh sắc ký gradient pha động pic CFM tỏch khỏi cỏc cephalosporin khỏc, pic cõn xứng. Độ phõn giải giữa pic cefadroxil và cefdinir là 5,2; giữa cefdinir và cefixim là 1,6; giữa cefixim và cefuroxim là 2,5; giữa cefuroxim và cefoperazon là 2,1.
Vỡ vậy chỳng tụi sử dụng chương trỡnh 2 là chương trỡnh gradient để tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
3.1.2.2. Khảo sỏt thể tớch tiờm mẫu
Sau khi lựa chọn chương trỡnh gradient, chỳng tụi đó tiến hành khảo sỏt cỏc thể tớch tiờm mẫu khỏc nhau để cú thể lựa chọn được thể tớch tiờm mẫu phự hợp (pớc cõn xứng, khụng bị doóng, nõng cao được đỏp ứng diện tớch pic). Với cỏc
điều kiện thực tế của mỏy múc sử dụng, chỳng tụi lựa chọn 3 thể tớch tiờm mẫu
để khảo sỏt là: 20 àl, 50 àl, 200 àl. Cỏc điều kiện sắc ký khỏc như mục 3.1.2.1. Kết quả thu được như sau:
- Về khả năng tỏch CFM khỏi cỏc cephalosporin khỏc: với cả 3 thể tớch tiờm mẫu, pic CFM đều tỏch khỏi pic của cỏc cephalosporin khỏc, pic cõn xứng.
- Về diện tớch pic của CFM kết quảđược ghi lại trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả khảo sỏt thể tớch tiờm mẫu
Thể tớch tiờm mẫu (àl) 20 50 200
Diện tớch pic (mAu.s) 32501 66860 180748
Với thể tớch tiờm mẫu 200 àl, pic CFM vẫn tỏch khỏi pic cỏc cephalosporin khỏc, pic cõn xứng, tăng đỏp ứng diện tớch pic. Việc tăng đỏp ứng diện tớch pic cú vai trũ rất quan trọng vỡ cú thể giỳp tăng giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng của phương phỏp. Do vậy, chỳng tụi chọn thể tớch tiờm mẫu 200 àl để tiến hành nghiờn cứu tiếp.
Chỳng tụi tiến hành quột phổ hấp thụ tử ngoại dung dịch chuẩn CFM cú nồng độ 500 ng/ml. Kết quả dung dịch này cú λmax = 285 nm (theo Hỡnh 3.8). Do
đú, bước súng 285 nm được lựa chọn để tiến hành phõn tớch.
Hỡnh 3.8. Phổ hấp thụ tử ngoại của cefixim
3.1.2.4. Khảo sỏt lựa chọn chuẩn nội
Qua quỏ trỡnh khảo sỏt điều kiện xử lý mẫu thỡ chỳng tụi nhận thấy trong 4 cephalosporin đưa vào nghiờn cứu cú cefdinir cú cỏc tớnh chất giống CFM nhất. Cả hai chất đều cú λmax = 285 nm (Hỡnh 3.9 là phổ hấp thụ tử ngoại của cefdinir). Mặt khỏc kết quả khảo sỏt quỏ trỡnh xử lý mẫu theo mục 3.1.1 cũng cho thấy: với quy trỡnh lựa chọn, hiệu suất thu hồi của cefdinir là tương đối cao (100,2%) và
ổn định (RSD = 0,59%). Ngoài ra kết quả sắc ký cũng cho thấy CFM và cefdinir cú pic tỏch nhau khỏ tốt với hệ số phõn giải là RS = 1,6 > 1,5 và thời gian phõn tớch hợp lý. Do đú, chỳng tụi quyết định lựa chọn cefdinir là chất chuẩn nội cho quỏ trỡnh phõn tớch CFM trong nước thải cụng nghiệp dược.