Chúng tôi tiến hành nuôi và tách chiết DNA từ 16 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh. Mỗi khuẩn lạc được nuôi trong 2ml môi trường LB lỏng có bổ sung Amp, lắc ở 370C với tốc độ 200 v/p, qua đêm. Sau đó chuyển dịch ni sang các ống eppendorf rồi ly tâm với tốc độ 12000 v/p trong 5 phút, thu dịch nổi. Bổ sung lần lượt các dung dịch Sol I, Sol II, Sol III, sau đó chiết lại bằng chloroform : isoamyl alcohol (24:1). Dung dịch Sol I có tác dụng hịa lại cặn tế bào thành hỗn dịch thuần nhất. SDS có trong dung dịch Sol II kết hợp với NaOH sẽ phá vỡ màng tế bào và giải phóng ra DNA. Trong mơi trường có dung dịch Sol II, độ pH cao lên trên 10. Dung dịch Sol III là đệm KOAc 3M, pH 5,5 có tác dụng trung hịa mơi trường sau khi đã phá vỡ tế bào làm cho các phần tử plasmit trở về trạng thái bình thường sau khi bị tháo xoắn trong điều kiện kiềm. Chiết dung dịch chlorofom, sau đó ly tâm sẽ làm cho DNA plasmit nằm ở pha nước ở phía trên, protein tủa cùng với xác tế bào sẽ nằm ở pha giữa, chloroform sẽ nằm ở pha cuối. Hút dịch nổi rồi tủa bằng muối NaOAc 3M pH 5,2 và cồn tuyệt đối ở -250C trong 2 giờ. Sau đó ly tâm thu cặn. Làm khơ cặn DNA rồi hịa lại trong 40µ TE chứa Rnase ủ ở 370C trong 1 giờ để loại bỏ RNA.
Các plasmit sau khi tách được kiển tra bằng điện di trên gel agarose 1% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 X 10 11 12 13 14 15 16
Hình 3.5. Kết quả tách DNA plasmit
X: DNA plasmit được tách chiết từ khuẩn lạc xanh.
10 – 16: DNA plasmit được tách chiết từ sản phẩm biến nạp của đầu 3’. Theo lý thuyết điện di thì phân tử DNA nào có kích thước càng lớn thì di chuyển càng chậm, nghĩa là trên ảnh quan sát được nó sẽ tạo thành một vạch sáng cao hơn so với các phân tử DNA có kích thước nhỏ hơn. Trong vecto tái tổ hợp, ngoài phần gốc là vecto PCRR 2.1 còn gắn thêm sản phẩm PCR nên khi di chuyển sẽ chậm hơn vecto gốc PCRR 2.1 là plasmit tách từ khuẩn lạc xanh. Quan sát kết quả điện di trên cho thấy có sự chênh lệch rõ rệt giữa các khuẩn lạc xanh và trắng. Các plasmit từ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 16 được tách từ khuẩn lạc trắng đều có đường chạy cao hơn so với plasmit được tách từ khuẩn lạc xanh. Điều này chứng tỏ các dịng pasmit này có khả năng mang gen mã hóa kháng nguyên HA.
Để có thể khẳng định các DNA plasmit được tách từ khuẩn lạc trắng có mang gen mã hóa kháng ngun HA hay khơng chúng tơi tiến hành kiểm tra phản ứng cắt với enzyme giới hạn EcoR I.