H5N1.
Sau khi tách chiết, 10ng RNA tổng số đã tách chiết được dùng làm sợi khn để nhân bản đoạn DNA đích bằng kỹ thuật RT-PCR, sử dụng bộ sinh phẩm SuperScripTM One step RT-PCR của hãng Invitrogen.
Vì vùng gen mã hóa cho các gen HA khá dài, để đảm bảo việc nhân bản gen thành công chúng tôi đã thiết kế hai cặp mồi khuếch đại gen theo hai đoạn riêng biệt nằm ở đầu 3’ và đầu 5’ của gen.
Cặp mồi dùng để khuếch đại đoạn gen ở đầu 5’ của gen HA có trình tự: H55PI: ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTG;
H55M14: GCATACTAGAGTTTATCGCCC.
Sản phẩm RT-PCR với cặp mồi này có chiều dài theo lý thuyết là 917 bp. Cặp mồi dùng để khuếch đại đoạn gen ở đầu 3’ của gen HA có trình tự: H53P5: CATCAACACTGAACCAGAGATTGG;
H53MS: TTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG.
Sản phẩm PCR với cặp mồi này có chiều dài theo lý thuyết là 1055 bp. Phản ứng phiên mã ngược được thực hiện theo chu trình nhiệt 500C - 30 phút, 940C – 2 phút; 30 chu kỳ (940C – 15 giây, X0C* - 50 giây, 720C- 1 phút 30 giây); 720C – 8 phút, 40C – ∞. Sau đó chuyển sang giữ ở 40C. Sản phẩm PCR (8µ) được kiểm ta điện di trên gel agarose 1%. (hình 3.2)
Hình 3.2. kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của gen HA trên gel agarose 1%
M: Thang DNA chuẩn. 1: Sản phẩm PCR đầu 3’. 2: Sản phẩm PCR đầu 5’.
Đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên HA của virus cúm đã được nhân lên một cách đặc hiệu, chỉ tạo ra một băng DNA duy nhất, khơng có sản phẩm phụ. Sản phẩm PCR được đối chiếu với thang DNA chuẩn, kích thước của sản phẩm PCR này đúng theo dự đốn lý thuyết: sản phẩm PCR đầu 3’ có chiều dài khoảng 1055bp, sản phẩm PCR đầu 5’ có chiều dài khoảng 917bp.
Kết quả này chứng tỏ chương trình thiết kế hoàn toàn hợp lý cả về mặt lý thuyết và kỹ thuật.