Phương pháp thí nghiệm tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Văn Cách (2004) với một chút biến đổi phù hợp với thí nghiệm. Để lựa chọn môi trường lên men thích hợp nhất đáp ứng điều kiện vừa giúp cho chủng xạ khuẩn sinh trưởng tốt nhất vừa mang lại hiệu suất sinh enzyme cao nhất, tiến hành thí nghiệm sử dụng 3 loại môi trường lên men cơ sở là: môi trường Gause I dịch thể, môi trường Gause II dịch thể và môi trường ISP- 4 [3].
Tiến hành thí nghiệm: Nhằm nghiên cứu để lựa chọn môi trường lên men thích hợp nhất chúng tôi chuẩn bị 6 bình tam giác dung tích 100ml có chứa 20 ml môi trường (ở mỗi bình môi trường có đánh ghi 3 loại môi trường khác nhau tương ứng 2 chủng xạ khuẩn) sau đó tiến hành nuôi lắc 220 vòng/ phút ở 28- 30oC trong 48 giờ, theo dõi sự sinh trưởng của chúng. Sau 48 giờ lọc thu sinh khối và dịch lọc enzymẹ Sinh khối đem sấy khô ở 45oC đến trọng lượng
không đổi, dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường xelluloza, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn. Dựa vào kết quả lượng sinh khối cao nhất và kết quả (D – d) cao nhất sẽ lựa chọn môi trường phù hợp nhất để làm môi trường lên men và môi trường sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theọ
3.3.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn
Phương pháp thí nghiệm tiến hành theo phương pháp của Trần Đình Toại (2008) với một chút biến đổi nhỏ phù hợp với phòng thí nghiệm. Để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng sinh trưởng ta tiến hành cần chuẩn bị đủ bình tam giác loại 250 ml, mỗi bình chứa 20 ml môi trường nuôi cấy với các giá trị khác nhau thay đổi tùy từng yếu tố, nuôi trên môi trường được lựa chọn ở 30oC trong 48 giờ, sau đó tiến hành lọc sinh khối và đem sấy khô đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 45oC. Chọn những giá trị của các yếu tố mà các chủng có khối lượng sinh khối khô lớn chứng tỏ chúng sinh trưởng mạnh ở những giá trị đó [15].
3.3.3. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng sinh enzyme và hoạt tính enzyme
Để xác định ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ, giá trị pH,nồng độ muối, nồng độ oxy,nguồn cacbon, nguồn nitơ tới khả năng sinh enzyme và hoạt tính enzyme thủy phân xelluloza, tinh bột, protein của các chủng xạ khuẩn, tiến hành thử sơ bộ theo phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch [15].
Cách tiến hành: Pha các môi trường phân giải xelluloza, tinh bột, protein. Sau khi thanh trùng 1atm/30 phút, đổ môi trường vào đĩa petrị Chờ cho môi trường nguội và đông lại, sau đó dùng khuyên đục lỗ (đường kính khoảng 1 cm) đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành các giếng thạch.
Chuẩn bị đủ bình tam giác loại 250 ml, mỗi bình cho 20 ml môi trường nuôi cấy với các giá trị khác nhau thay đổi tùy từng yếu tố, nuôi chủng xạ khuẩn trên máy lắc 220 vòng/ phút ở 30oC trong 48 giờ, sau đó tiến hành thu và lọc sinh khối xạ khuẩn. Thu dịch enzyme từ môi trường nuôi cấy bằng cách ly tâm 15.000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ cặn. Nhỏ vào các lỗ khoan trên môi
trường cơ chất tương ứng dịch nuôi cấy xạ khuẩn. Sau đó đặt các đĩa vào tủ lạnh 4oC trong vòng 6 - 8 giờ rồi chuyển sang tủ ấm 30oC. Sau 12 - 24 giờ, xác định vòng phân giải bằng thuốc thử lugol. Cho vào mỗi hộp petri 10 ml thuốc thử lên tương ứng 3 môi trường xelluloza, tinh bột, casein [2].Tráng đều bề mặt, gạn hết dịch thuốc thử, để 5 phút, vùng hoạt tính enzyme phân giải xelluloza, tinh bột, protein là vùng phân giải không màu xung quanh lỗ đục.
Đánh giá khả năng sinh enzyme và có hoạt tính enzyme cao: dùng thước đo đường kính vòng phân giải là D. (D – d) càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng cao (d là đường kính giếng, d =10mm). Chọn những giá trị của các yếu tố mà kết quả (D – d) lớn nhất.
3.3.4. Phương pháp xác định yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn phát triển của xạ khuẩn
3.3.4.1. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhằm lựa chọn nhiệt độ phù hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzyme của chủng xạ khuẩn, các chủng xạ khuẩn được cấy vào môi trường, trong nghiên cứu này cần chuẩn bị 12 bình tam giác loại 100ml, mỗi bình cho 20ml (ở mỗi bình môi trường có đánh ghi điều kiện nhiệt độ khác nhau tương ứng với 2 chủng xạ khuẩn), nuôi lắc 220º vòng/ phút ở các thang nhiệt độ 25o
C, 30oC, 37oC, 45oC, 50oC, 55oC. Sau 48 giờ lọc thu sinh khối và dịch lọc enzymẹ Sinh khối đem sấy khô ở 45o
C đến trọng lượng không đổi để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn. Dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch môi trường xelluloza, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn.
3.3.4.2. Xác định ảnh hưởng của pH môi trường.
Nhằm xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng xạ khuẩn trên môi trường, trong nghiên cứu này cần chuẩn bị 14 bình tam giác loại 100 ml, mỗi bình chứa 20 ml môi trường ứng với các giá trị pH thay đổi từ 4-10 (ở mỗi bình môi trường có ghi các giá trị pH khác nhau, tương ứng với 2 chủng xạ khuẩn). Sử dụng HCl 1N và NaOH 1N để điều chỉnh pH của môi trường. Cấy các chủng xạ khuẩn nghiên cứu vào các bình môi trường, đem nuôi lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ. Sau đó lọc thu sinh khối và dịch lọc enzymẹ Sinh khối đem sấy khô ở 45o
không đổi để xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn. Dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường cellulose, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn.
3.3.4.3. Khả năng chống chịu nồng độ muối khác nhau:
Nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl tới khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng xạ khuẩn, trong nghiên cứu này cần chuẩn bị 14 bình tam giác loại 100 ml, mỗi bình cho 20 ml môi trường vào với nồng độ muối thay đổi từ 0-1-3-5-7-9-11% (ở mỗi bình môi trường có đánh dấu ở các nồng độ muối khác nhau, tương ứng 2 chủng xạ khuẩn). Sau đó tiến hành nuôi lắc 220 vòng/ phút ở 30oC trong 48h, theo dõi sự sinh trưởng của chúng. Sau 48 giờ lọc thu sinh khối và dịch enzymẹ Sinh khối đem sấy khô ở 45o
C đến trọng lượng không đổi để xác định ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn. Dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường xelluloza, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn.
3.3.4.4.Xác định nhu cầu oxy:
Nhằm nghiên cứu nhu cầu sử dụng oxy cho sự sinh trưởng và sinh enzyme của 2 chủng xạ khuẩn cần tiến hành nuôi chúng trên các thể tích môi trường khác nhaụ Các chủng xạ khuẩn sau khi được hoạt hóa trên môi trường, tiến hành lấy 1000 µl cho vào10 bình tam giác có dung tích là 500ml chứa thể tích dịch môi trường lần lượt là 25ml, 50ml, 75ml, 100ml, 125ml, 150ml nuôi lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ là 30oC trong 48 giờ. Sau 48 giờ tiến hành lọc thu sinh khối và dịch lọc enzymẹ Sinh khối đem sấy khô ở 45o
C đến trọng lượng không đổi để xác định ảnh hưởng của nồng độ oxy tới khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn. Dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường xelluloza, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn.
3.3.4.5. Khả năng sử dụng nguồn cacbon:
Nhằm xác định khả năng phát triển và sinh tổng hợp enzym trên cơ sở thành phần của môi trường, chỉ thay thế tinh bột bằng các nguồn cacbon khác nhau với nồng độ như nhau: Tinh bột (1%), Xenluloza (1%), Glucose (1%),
Saccaroza (1%), Lactose (1%),CMC (1%). Sau khi khử trùng ướt môi trường (1atm/30phút) ta tiến hành cấy các chủng xạ khuẩn vào các bình dung tích 100ml chứa 20ml môi trường rồi đem đi nuôi lắc trong thời gian 48 giờ ở 30oC cho các chủng phát triển. Sau 48 giờ lọc thu sinh khối và dịch lọc enzymẹ Dịch lọc dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường cellulose, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn.
3.3.4.6. Khả năng sử dụng nguồn Nitơ:
Xác định khả năng phát triển và sinh tổng hợp enzym trên cơ sở thành phần của môi trường, chỉ thay thế KNO3 bằng các nguồn nitơ khác nhau với nồng độ bổ sung 0,25%. Sử dụng các nguồn nitơ khác nhau: Pepton, cao nấm men, KNO3, (NH4)2SO4, bột đậu tương. Sau khi khử trùng ướt môi trường (1atm/30phút) chia vào các bình tam giác 100ml (mỗi bình 20ml). Sau đó cấy các chủng xạ khuẩn vào các bình môi trường với số lượng sinh khối bằng nhau rồi đem nuôi lắc trong thời gian 48 giờ ở nhiệt độ là 30oC. Sau 48 giờ ngày lọc thu sinh khối và dịch lọc enzymẹ Sinh khối đem sấy khô 45o
C đến trọng lượng không đổi để xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn. Dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch môi trường xelluloza, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4. Lên men trên thiết bị Infors HT (Switzerland) và tạo chế phẩm
Nhân giống cấp 1: Nhân giống trong môi trường Gause I dịch thể, nuôi cấy trong bình tam giác ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
Nhân giống cấp 2: Các chủng giống cấp 1 đã phát triển tốt được cấy chuyền bình môi trường lỏng với tỷ lệ 10% giống nuôi ở 30o
C.
Lên men: Tiếp giống từ giống cấp 2 sang thiết bị Infors HT (Switzerland) đã cài đặt những thông số thích hợp( dựa trên kết quả nghiên cứu trên). Nghiên cứu động học lên men của từng chủng xạ khuẩn trên thiết bị lên men Infors HT (Switzerland) đã cài đặt các thông số tối ưu, nguồn cacbon, nitơ thích hợp bằng cách xác định lượng sinh khối khô thu được trong 1ml dịch được lấy ra cứ sau 3 giờ chạy thiết bị, cứ sau 3 giờ lại lấy ra 1ml dịch lên men, lọc và sấy khô tới giá trị không đổi, cân và thu kết quả sinh khối khô.
Các thông số như nhiệt độ, pH, nồng độ oxy thể hiện trên màn hình( out put hoặc in put). Kết quả của lượng sinh khối khô lớn hay nhỏ thể hiện sự sinh trưởng mạnh hay yếu của chủng xạ khuẩn tại thời điểm đó. Ở pha log các tế bào sinh trưởng mạnh, nhân đôi một cách đều đặn, sinh khối tăng theo thời gian. Ở pha ổn định tế bào giữ được sự ổn định về kích thước và số lượng, các tế bào sinh ra tương đương với số tế bào chết đi, kết quả là sinh khối được giữ ở mức ổn định.Thường thì việc ly tâm thu sinh khối và enzyme thực hiện ở đầu pha ổn định.
3.5. Phương pháp nghiên cứu tính đối kháng
Ở vấn đề này chúng tôi tập trung nghiên cứu về giữa 2 chủng xạ khuẩn. Từ các chủng xạ khuẩn chúng tôi tiến hành cấy trên đĩa petri môi trường Gause I thạch đĩa đã được chuẩn bị trước. Mỗi chủng vi sinh vật được cấy theo một đường ngang và một đường dọc sao cho tất cả các chủng đều có điểm giao cắt lẫn nhaụ Đem nuôi ở trong tủ ấm nhiệt độ là 30o
C trong 5 ngày rồi quan sát sự đối kháng của chúng.
3.6. Phương pháp lựa chọn chất mang phù hợp
Nhằm lựa chọn chất mang phù hợp nhất cho chế phẩm, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thí nghiệm các cơ chất là than bùn, cám ngô, bột đậu tương. Tiến hành phối trộn các chất mang theo tỷ lệ (60: 30: 10; 50:40:10; 70:20:10) với tổng khối lượng đều bằng 10g, sau đó cho vào các bình 250ml mang đi thanh trùng ở 105oC trong 30 phút, để nguộị Từng chủng xạ khuẩn được nhân giống cấp 1, cấp 2 trong bình tam giác, rồi bổ sung 10% giống cấp 2 vào các bình hỗn hợp chất mang, trộn đều, nuôi trong tủ ấm 30o
C. Sau 5 ngày đem các bình chứa 2 chủng xạ khuẩn tương ứng với các tỷ lệ ra tiến hành pha loãng tới nồng độ pha loãng là 10-6, hút lần lượt 100µl dịch ở nồng độ pha loãng 10-6 và tiến hành cấy trải vào 2 đĩa thạch đã chuẩn bị sẵn(có đánh dấu từng chủng tương ứng với tỷ lệ phối trộn), nuôi ở tủ ấm 28- 30o
C, sau 5- 7 ngày đem ra đếm số lượng khuẩn lạc. Thông qua kết quả số lượng khuẩn lạc trung bình, có thể lựa chọn tỷ lệ các cơ chất nào phù hợp nhất.
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp
Tiến hành thí nghiệm, lọc thu sinh khối và dịch lọc enzymẹ Sinh khối đem sấy khô ở 45o
C đến trọng lượng không đổi, dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường xelluloza, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase, protease của các chủng xạ khuẩn. Dựa vào kết quả lượng sinh khối cao nhất và kết quả đường kính vòng phân giải D – d(mm) cao nhất sẽ lựa chọn môi trường phù hợp nhất để làm môi trường lên men và môi trường sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theọ
Kết quả lựa chọn môi trường làm môi trường lên men và môi trường sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo phụ thuộc vào lượng sinh khối khô(mg/ml) thu được thể hiện ở bảng 4.1 và hình 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả lượng sinh khối khô
Chủng Sinh khối khô (mg/ml)
Gause I Gause II ISP - 4
T1 7,56 5,12 4,65 T4 7.72 6,24 3,78 7,56 7,72 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Gause I Gause II ISP - 4 Môi trường
T1 T4 S in h k h ố i k h ô ( m g /m l)
Hình 4.1. Kết quả lượng sinh khối khô
Kết quả ở bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy lượng sinh khối khô thu được lớn nhất của chủng Streptomyces sp. T1 là lên men trong môi trường Gause I:
7,56(mg/ml), của chủng Streptomyces sp. T4 là trong môi trường lên men Gause I: 7,7 2(mg/ml). Như vậy, lượng sinh khối khô thu được cao nhất của cả 2 chủng đều trong môi trường Gause Ị So sánh trong môi trường Gause I thấy lượng sinh khối khô thu được của chủng Streptomyces sp. T1 thấp hơn lượng sinh khối khô thu được của chủng Streptomyces sp. T4 là 0,16(mg/ml). Qua kết quả trên chúng tôi thấy môi trường Gause I thích hợp nhất cho cả 2 chủng sinh trưởng.
Kết quả lựa chọn môi trường thích hợp nhất làm môi trường lên men và môi trường sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo là kết quả đường kính vòng phân giải D – d(mm) cao nhất thể hiện ở bảng 4.2 và hình 4.2
Bảng 4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của môi trường lên hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn
Chủng xạ khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hoạt tính cellulase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Gause I Gause II ISP - 4
T1 17 13 12
T4 16 11 14
Chủng xạ khuẩn Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Gause I Gause II ISP - 4
T1 14 12 11
T4 13 11 12
Chủng xạ khuẩn Hoạt tính protease(đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Gause I Gause II ISP - 4
T1 13 9 10
17 13 12 16 11 14 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Gause I Gause II ISP - 4 Môi trường
D -d ( m m ) T1 T4
Hoạt tính cellulase (Đường kính vòng phân giải D-d, mm)
14 12 11 13 11 12 0 5 10 15
Gause I Gause II ISP - 4 Môi trường
D -d ( m m ) T1 T4
Hoạt tính amylase (Đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Hoạt tính protease (Đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Hình 4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của môi trường lên hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn
Kết quả trên bảng 4.2 và hình 4.2 cho thấy trong 3 môi trường lên men, dịch lên men ở cả 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều cho hoạt tính enzyme lớn