Cân 1kg dược liệu đã làm nhỏ, cho nước ngập dược liệu (cách bề mặt dược liệu khoảng 2cm), đun sôi trong 30 phút. Sau 30 phút, lấy dịch chiết ra, lọc nóng được dịch lọc. Bã dược liệu được dùng để chiết tiếp lần 2, lần 3. Gộp các dịch lọc lại, lấy một phần đem cô đến cắn (cắn toàn phần). Phần còn lại bay hơi bớt dung môi rồi chuyển vào bình gạn. Tiến hành chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần lần lượt là: n-hexan, chloroform và ethyl acetat. Dịch chiết các phân đoạn được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn lần lượt là n-hexan (cắn H), chloroform (cắn C) và cắn ethyl acetat (cắn E).
Hình 3.15 mô tả sơ đồ chiết xuất cắn toàn phần và các cắn phân đoạn từ lá Sa kê.
Hình 3.13. Ảnh một số đặc điểm bột lá Sa kê
1. Lông che chở đơn bào 2. Mảnh biểu bì mang lỗ khí
3. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai 4. Hạt tinh bột 5. Mảnh mô mềm 6. Mảnh mô giậu 7. Các mảnh mang màu 8. Mảnh mạch xoắn
9. Mảnh mạch vạch 10. Sợi
Hình 3.14. Ảnh một số đặc điểm bột thân Sa kê
1. Mảnh biểu bì 2. Mô mềm 3. Mảnh mạch điểm
4. Mảnh mạch xoắn 5. Sợi gỗ 6. Hạt tinh bột 7. Tinh thể calci oxalat 8. Mảnh mang màu
Hình 3.15. Sơ đồ chiết xuất cắn toàn phần và các cắn phân đoạn từ lá Sa kê
3.2.2. Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong dược liệu bằng phản ứng hóa học.
3.2.2.1. Định tính glycosid tim
Lấy 3g dược liệu, chiết soxhlet với n-hexan 1 giờ. Bã dược liệu sấy khô, cho vào bình cầu, đun hồi lưu với ethanol 40% trong 1 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc loại tủa, thử
Dịch chiết nước
n-Hexan
Dịch chiết n-hexan
n-Hexan thu hồi
Cắn H
Dịch chiết nước
Dịch chiết chloroform
Chlorform
Cắn C
Chloroform thu hồi
Dịch chiết nước
Ethyl acetat
Dịch chiết nước Dịch chiết ethyl acetat
Cắn E
Ethyl acetat thu hồi
Nước cất Dược liệu
dịch lọc vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với hỗn hợp chloroform:ethanol tỷ lệ 4:1 (3 lần, mỗi lần 5ml), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch. Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thuỷ cho đến khô. Cắn còn lại để làm các phản ứng định tính sau:
Phản ứng Liebermann:
Hòa tan cắn trong ống nghiệm 1 bằng 1ml anhydrid acetic, lắc đều. Nghiêng ống 450, cho từ từ theo thành ống 1ml H2SO4 đặc. Quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp xuất hiện vòng vàng thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Phản ứng Baljet:
Hòa tan cắn trong ống nghiệm 2 bằng khoảng 1ml ethanol 90%, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Phản ứng Legal:
Hòa tan cắn trong 0,5ml ethanol 90%. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natrinitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không chứa glycosid tim.
3.2.2.2. Định tính alkaloid
Lấy 2g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình cầu dung tích 50ml, thấm ẩm dược liệu bằng dd NH3 6 M, để yên 1 giờ. Chiết hồi lưu chlorofrom trong vòng 30 phút, lọc lấy dịch chiết. Lắc dịch chiết chlorofrom với acid H2SO4
1N (2 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết nước, cho vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống nghiệm 1ml, để làm các phản ứng sau.
Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2-3 giọt thuốc thử
Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính.
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2-3 giọt thuốc thử
Dragendoff, nếu thấy xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không chứa alkaloid.
3.2.2.3. Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong cắn toàn phần bằng phản ứng hóa học
Định tính saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Hòa tan một ít cắn vào khoảng 5ml nước cất. Đun cách thủy 10 phút, lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm to. Thêm nước cất đến khoảng 10ml, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát cột bọt thấy cột bọt bền sau 15 phút thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dịch chiết nước có chứa saponin.
Định tính flavonoid
Hòa tan cắn vào ethanol 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc đem làm các phản ứng:
Phản ứng với hơi amoniac (NH3)
đặc, quan sát nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng thì dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính.
Phản ứng với dung dịch kiềm loãng
Cho dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10% nếu thấy dịch vẩn đục màu vàng thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính. Phản ứng Cyanidin
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1ml dịch lọc, 1 ống thêm ít bột magie kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt HCl đậm đặc, ống còn lại để đối chiếu. Khi phản ứng xong quan sát nếu thấy ống phản ứng xuất hiện màu đỏ cam đậm hơn ống đối chiếu thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid
Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều nếu thấy xuất hiện màu xanh đen thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính. Phản ứng diazo hóa:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch lọc, thêm vào đó khoảng 1ml dung dịch NaOH 10%, thêm vài giọt thuốc thử diazoni, lắc đều, đun nóng cách thủy nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dịch chiết nước có chứa flavonoid.
Định tính coumarin
Chuẩn bị dịch lọc như phần định tính flavonoid để làm các phản ứng: Phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch lọc, ống 1 thêm 0,5ml NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện
tượng ống 1 có tủa đục màu vàng, ống 2 trong suốt. Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4ml, ống 1 trong suốt, ống 2 có tủa đục. Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans:
Nhỏ hai giọt dịch chiết ethanol lên giấy lọc, sau đó nhỏ tiếp lên 1 giọt NaOH 10%, để khô. Che nửa vết chất thử bằng một mảnh kim loại rồi soi dưới ánh sáng tử ngoại trong khoảng 30 giây, bỏ vật che ra thấy nửa của vết chất thử không che có cường độ màu sáng hơn nửa vết chất thử bị che thì phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dịch chiết nước không có coumarin.
Định tính anthranoid
Phản ứng Borntraeger:
Hòa tan một ít cắn vào 10ml H2SO4 1N. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc cho vào bình gạn. Chiết bằng 10ml chloroform, gạn lấy lớp chloroform vào ống nghiệm, cô bớt dung môi còn khoảng 1ml, thêm 1ml NaOH 10% vào, lắc nhẹ, nếu xuất hiện màu đỏ sim thì phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dịch chiết nước có chứa anthranoid.
Định tính acid hữu cơ
Hòa tan cắn trong nước nóng, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 nếu thấy có bọt khí bay lên thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Định tính tanin
Hòa tan cắn trong nước nóng. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 2ml dịch lọc.
Ống 1: Thêm vài giọt sắt (III) chlorid 5% nếu thấy xuất hiện tủa màu xanh đen thì dương tính.
Ống 2: Thêm vài giọt chì acetat 10% nếu thấy xuất hiện tủa bông thì dương tính.
Ống 3: Thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dịch chiết nước có chứa tanin.
Định tính đường khử
Hòa tan cắn vào 1ml nước nóng, đem lọc thu được dịch lọc. Thêm vào đó 1ml dung dịch thuốc thử Felling A và 1ml dung dịch thuốc thử Felling B. Đun cách thủy sôi vài phút nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dịch chiết nước có chứa đường khử.
Định tính acid amin
Hòa tan cắn vào 2ml nước nóng. Lọc nóng, lấy dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm 5 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy 2 phút nếu thấy xuất hiện màu tím thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dịch chiết nước có chứa acid amin.
Định tính polysaccharid
Hòa tan cắn vào 4ml nước nóng, lọc nóng thu được dịch lọc. Cho vào 2 ống nghiệm
Ống 2: 4ml dịch lọc + 5 giọt thuốc thử Lugol
Quan sát màu ống 2 đậm hơn ống 1 thì dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dịch chiết nước có chứa polysaccharid.
Định tính chất béo
Hòa tan cắn vào 2ml nước nóng, lọc nóng. Nhỏ 1 giọt dịch chiết trên lên miếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hết hơi dung môi, nếu để lại vết mờ trên giấy lọc thì phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dịch chiết nước không có chất béo.
Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm nhỏ một ít cắn khô, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn nếu thấy xuất hiện màu xanh lá thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dịch chiết nước không có caroten.
Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm một ít cắn khô, hòa tan trong 2ml chloroform và 1ml anhydrid acetic. Để ống nghiệm nghiêng 450, thêm từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dịch chiết nước có sterol.
Các kết quả định tính được trình bày tóm tắt ở bảng 3.2.
Kết luận: Sơ bộ kết luận lá Sa kê không chứa glycosid tim, alkaloid;
dịch chiết nước có saponin, flavonoid, anthranoid, tanin, đường khử, acid amin, polysaccharid, sterol; không chứa coumarin, acid hữu cơ, chất béo, caroten.
Bảng 3.2. Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong lá Sa kê Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận 1 Glycosid tim Phản ứng Libermann - Không Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - 2 Alkaloid
Phản ứng với thuốc thử Mayer -
Không
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat -
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff -
3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt + Có
4 Flavonoid
Phản ứng với hơi amoniac ++
Có
Phản ứng với dung dịch kiềm loãng ++
Phản ứng Cyanidin +
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% ++
Phản ứng diazo hóa ++
5 Coumarin
Phản ứng mở đóng vòng lacton -
Không Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-
trans -
6 Anthranoid Phản ứng Borntraeger ++ Có
7 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Không
8 Tanin
Phản ứng với dd FeCl3 5% ++
Có
Phản ứng dd chì acetat 10% ++
Phản ứng với dd gelatin 1% ++
9 Đường khử Phản ứng với TT Fehling A và Fehling B ++ Có
10 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% + Có
11 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol ++ Có
12 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy - Không
13 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc - Không
14 Sterol Phản ứng Liebermann + Có
Ghi chú:(-): Phản ứng âm tính (+): Phản ứng dương tính (++): Phản ứng dương tính rõ