Tiến hành sắc ký với những điều kiện đã chọn nhưng với tốc độ dòng thay đổi: 0.8 ml/phút, 1 ml/ phút, 1.2 ml/phút.
Ở tốc độ 0.8 ml/ phút và 1.2 ml/ phút: Không tách được 1 số pic trên sắc ký đồ.
Nhận xét: tốc độ dòng 1 ml/phút có khả năng tách tốt nhất các pic trên sắc ký
đồ, nên lựa chọn tốc độ này trong phân tích tiếp theo.
Điều kiện sắc ký lựa chọn
Từ các kết quả khảo sát, tiến hành xây dựng chương trình sắc ký có khả năng tách các saponin trong GCL như sau:
Thể tích tiêm mẫu: 15 µL.
Detector UV: bước sóng 203 nm. Thời gian chạy: 60 phút.
Tốc độ dòng: 1ml/phút.
Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Hệ dung môi ACN : H20 với chương trình sắc ký như sau:
Khoảng thời gian (phút) Nồng độ % của ACN
0 25
0-29 47
29-50 47
50-53 80
Hình 3.4 Sắc ký đồ của các saponin trong GCL (khảo sát điều kiện sắc ký) 3.2.5. Đánh giá chuẩn nội Rb1
Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn Rb1 (1 mg/ ml) với điều kiện sắc ký vừa khảo sát.
So sánh với sắc ký đồ của các saponin trong GCL (Hình 3.4).
Hình 3.5. Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Rb1
Hình 3.5 cho thấy tại thời gian lưu của chuẩn Rb1 (t= 16.425) trong mẫu thử không có pic saponin nào. Do đó có thể sử dụng chuẩn Rb1- một loại saponin có cấu trúc và tính chất tương tự các gypenosid như 1 chất đánh dấu (Marker) để tính toán các thông số đặc trưng như thời gian lưu tương đối (RRT= thời gian lưu của pic thử/ thời gian lưu của pic Rb1) và diện tích pic tương đối (RPA= Diện tích pic của pic thử/ Diện tích pic của pic Rb1).
Chuẩn bị mẫu định tính Giảo cổ lam:
Từ các dữ liệu khảo sát trên, tiến hành chuẩn bị các mẫu phân tích:
- Dung dịch thử: chuẩn bị như mục 2.3.1 được cắn B sau đó hòa tan trong ACN 25% và chuyển vào bình định mức 20ml (Dung dịch B).
- Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/ml.
- Trước khi tiêm mẫu thử vào hệ thống HPLC để phân tích, dung dịch chuẩn Ginsenoside Rb1 được thêm vào dung dịch thử như là một maker theo tỉ lệ VDung dịch B : VDung dịch chuẩn= 4:1. Lọc dung dịch qua màng lọc 0.45 µm.
3.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 3.3.1. Tính phù hợp của hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp chuẩn Rb1 (1mg/ml) và tiến hành chạy với chương trình đã khảo sát. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký
STT Thời gian lƣu (phút) Diện tích pic (mAU*s) 1 16.475 1025.4 2 16.520 1031.2 3 16.473 1036.1 4 16.451 1035.5 5 16.450 1039.2 6 16.442 1032.1 TB 16.469 1033.3 RSD (%) 0.173 0.465
Nhận xét: Kết quả cho thấy RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic của
chuẩn Ginsenosid Rb1 đối với 6 phép thử < 2%. Điều này chứng tỏ hệ thống phù hợp cho việc định tính các saponin trong GCL.
3.3.2. Độ ổn định
Tiêm mẫu tại các thời điểm: 0h, 2h, 6h, 8h, 12h, 24h.
Tính trung bình RRT và RPA của các pic ở 6 thời điểm trên (Bảng 3.3). RRT = Thời gian lưu của các pic saponin / Thời gian lưu của pic Rb1. RPA = Diện tích pic của pic saponin / Diện tích pic của pic Rb1.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ ổn định của quy trình phân tích
Pic RRT (TB của 6 thời điểm) RSD (%) RPA (TB của 6 thời điểm) RSD (%) Rb1 1 0 1 0 1 0.82 0.22 0.33 2.39 2 0.85 0.36 0.28 1.16 3 0.88 0.10 0.12 3.02 4 0.93 0.08 0.07 3.86 5 1.02 0.08 0.05 7.11 6 1.08 0.07 0.46 2.09 7 1.17 0.17 0.67 1.23 8 1.55 0.17 0.64 1.52 9 1.60 0.16 1.44 0.96 10 1.65 0.16 0.63 1.44 11 1.69 0.19 1.12 0.77 12 1.76 0.16 0.04 3.39 13 1.79 0.20 0.08 4.99 14 1.84 0.16 0.06 5.82 Nhận xét:
- Thông số RRT (Thời gian lưu tương đối): Giá trị RSDRRT của tất cả 14 pic saponin đặc trưng ≤ 0.36 %. Chứng tỏ phương pháp có độ ổn định trong 24h.
- Thông số RPA (Diện tích pic tương đối): Trong 14 pic saponin đặc trưng có 12 pic saponin có giá trị RSDRPA < 5%. Có 2 pic saponin số 5, 14 có giá trị RSDRPA > 5%. Có thể do 2 saponin này có hàm lượng rất thấp, ảnh hưởng của đường nền khiến việc xác định diện tích pic chưa chính xác.
3.3.3. Độ lặp lại
Tiến hành phân tích 6 phép thử song song của cùng 1 mẫu thử (Cùng quy trình chiết xuất - tinh chế và xử lý mẫu).
Đánh giá thông số RRT các pic saponin đặc trưng, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình phân tích
Pic RRT (TB của 6 mẫu) RSD (%) Pic RRT (TB của 6 mẫu) RSD (%) Rb1 1 0 8 1.55 0.1 1 0.82 0.34 9 1.59 0.11 2 0.86 0.18 10 1.64 0.11 3 0.88 0.09 11 1.68 0.12 4 0.93 0.06 12 1.74 0.13 5 1.02 0.08 13 1.79 0.62 6 1.08 0.07 14 1.83 0.14 7 1.16 0.05 Nhận xét:
Giá trị RSDRRT của tất cả 14 pic saponin đặc trưng ≤ 0.62 %. Chứng tỏ phương pháp chiết xuất - tinh chế và xử lý các mẫu có độ lặp lại tốt.
3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC MẪU GCL THU HÁI TẠI ĐÀ LẠT
Sử dụng phương pháp phân tích như trên lần lượt cho 5 mẫu khác nhau, kết quả thu được như sau:
Mẫu ĐL1: vùng trồng 1, cây 4 tháng thu hái năm đầu
Mẫu ĐL2: vùng trồng 2, cây 4 tháng thu hái năm đầu
Mẫu ĐL3: vùng trồng 3, cây 4 tháng thu hái năm đầu
Mẫu ĐL4: vùng trồng 1, cây 3 tháng thu hái năm đầu
Mẫu ĐL4: vùng trồng 1, cây 4 tháng thu hái năm thứ 2
Hình 3.6. Sắc ký đồ của 5 mẫu GCL
Kết quả sắc ký đồ của 5 mẫu Giảo cổ lam được trồng và thu hái tại Đà Lạt cho thấy có 14 pic saponin (Đánh số từ 1 đến 14). 14 pic này xuất hiện
đồng thời ở cả 5 mẫu (3 vùng trồng, thu hái trong các thời điểm khác nhau), có khoảng tin cậy về RRT các mẫu cao (bảng 3.5).
Bảng 3.5. Khoảng tin cậy (95%) của 5 mẫu GCL thu hái tại Đà Lạt
Pic TB RRT của 5 mẫu Khoảng tin cậy 95% Pic TB RRT của 5 mẫu Khoảng tin cậy 95% Rb1 1 ± 0 8 1.548 ± 0.007 1 0.820 ± 0.005 9 1.595 ± 0.006 2 0.856 ± 0.004 10 1.639 ± 0.010 3 0.882 ± 0.002 11 1.683 ± 0.009 4 0.928 ± 0.001 12 1.747 ± 0.010 5 1.019 ± 0.002 13 1.803 ± 0.036 6 1.076 ± 0.002 14 1.834 ± 0.011 7 1.163 ± 0.003 Nhận xét:
- Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn, kết hợp với kỹ thuật quét phổ xác nhận được trong các mẫu Giảo cổ lam tại Đà Lạt có 14 pic saponin đặc trưng.
- Hình dạng sắc ký tương đồng giữa các mẫu. Khả năng phân tách tốt.
- Các saponin phân bố tâp trung trong khoảng thời gian từ 13.5 phút đến 30.5 phút theo chương trình sắc ký đã chọn.
3.5. BÀN LUẬN
Về phƣơng pháp chiết xuất và tinh chế mẫu
Để định tính saponin toàn phần trong GCL cho kết quả hợp lý và đáng tin cậy, trước hết cần phương pháp chiết xuất và tinh chế tối ưu.
Chiết siêu âm với dung môi EtOH 70%. Đây là phương pháp dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhanh chóng, sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, không độc hại, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt và cho hiệu suất chiết cao.
Tinh chế sử dụng phương pháp chiết pha rắn sử dụng nhựa hấp phụ Diaion HP-20, rửa giải bằng MeOH trong khoảng nồng độ từ 50-80%. Đây là phương pháp có độ lặp lại tốt, quy trình đơn giản, dễ thực hiện, sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, loại được nhiều tạp chất mà không làm hao hụt saponin. Về khảo sát điều kiện sắc ký và thẩm định phƣơng pháp
Dựa trên các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát cực đại hấp thụ và các điều kiện chạy sắc ký theo mục 3.2. Xác định được bước sóng hấp thụ cực đại, lựa chọn được các điều kiện chạy sắc ký tối ưu.
Sau khi xây dựng một quy trình định tính, để áp dụng quy trình vào thực tế một cách chính xác, cho kết quả tin cậy, cần thẩm định lại phương pháp theo quy định chung. Phương pháp phân tích đã được thẩm định dựa trên tính tương thích, độ ổn định của hệ thống và độ lặp lại đủ điều kiện để sử dụng phân tích định tính các saponin trong Giảo cổ lam tại Việt Nam.
Định tính xác định dấu vân tay bằng HPLC đối với dƣợc liệu Giảo cổ
lam
Giảo cổ lam (G. pentaphyllum) là một loại thuốc khá thông dụng trên thế giới; Dược điển Hồng Kông đã giới thiệu chuyên luận về Giảo cổ lam. Thành phần hoạt chất chính là saponin trong Giảo cổ lam rất phức tạp và hiện vẫn chưa có phương pháp HPLC nào định lượng được công bố. Phương pháp định tính sử dụng các đặc điểm sắc ký đồ HPLC làm vết vân tay giúp việc kiểm soát chất lượng giảo cổ lam hiệu quả hơn. Một khó khăn nữa là các chất
chuẩn, maker saponin trong Giảo cổ lam khó phân tách và chưa được thương mại. Việc lựa chọn Rb1 làm chuẩn nội rất có ý nghĩa vì có cấu trúc và tác dụng tương đồng, hơn nữa Rb1 khá thông dụng để làm maker [18].
A B C D
Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC bốn tiểu vùng A, B, C, D saponin trong GCL
Sắc ký đồ các saponin của 5 mẫu Giảo cổ lam thu tại Đà Lạt khá thống nhất (hình 3.6). Các mẫu 1, 4, 5 trồng tại vùng trồng 1 cho pic của 14 saponin rất rõ ràng, trong đó mẫu 5 thu được ở năm trồng thứ 2 là tốt nhất. Mẫu 1 và 4 không khác nhau nhiều cho thấy lượng saponin thu hoạch 3 tháng và 4 tháng
như nhau; nhưng thực tế vẫn thu hoạch ở tháng thứ 4 do cây sinh ra lượng sinh khối lớn hơn nhiều.
Sắc ký đồ HPLC các saponin trong dược liệu Giảo cổ lam cho 14 pic saponin, có thể chia thành 4 tiểu vùng A, B, C, D. Tiểu vùng A, B, C có 11 pic khá rõ ràng, hàm lượng tương đối lớn; riêng tiểu vùng D có 3 pic 12, 13, 14 hàm lượng thấp. Khi phân tích cùng điều kiện sắc ký với các mẫu thu hái mọc hoang tại Sapa (Lào Cai), Hòa Bình, Tam đảo (Vĩnh Phúc) có thể nhận thấy vùng C (pic 8, 9, 10, 11) là vùng đặc hiệu cho tất cả các mẫu G. pentaphyllum và đặc trưng cho Giảo cổ lam tại Việt Nam.
Từ thực tế nghiên cứu đề tài xin được đề nghị định tính vết vân tay các saponin trong Giảo cổ lam theo quy trình sau:
1. Dung dịch chuẩn Rb1:
- Cân 1mg Ginsenoside Rb1 và hòa tan trong 1ml ACN 25%.
2. Dung dịch thử:
- Chiết 1g dược liệu GCL bằng phương pháp siêu âm với EtOH 70% (3 lần
x 20ml/ lần, t = 10 phút, P = 40%). Gộp dịch chiết, lọc. Bốc hơi dung môi đến cắn. Hòa tan trong 3ml nước cất (dung dịch A).
- Ngâm 10g nhựa Diaion HP-20 trong dung dịch A, khuấy trộn nhẹ nhàng trong 1h. Tiến hành nhồi lên cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 2,5cm, chiều dài 25cm.
- Rửa giải: Rửa lần lượt bằng nước cất và MeOH 20% đến khi hết màu để
loại tạp. Sau đó rửa bằng MeOH từ 50% đến 80%, gộp dịch rửa giải, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn. Hòa tan trong 20ml ACN 25% được dung dịch B. Thêm dung dịch chuẩn Rb1 (1mg/ml) vào dung dịch B với tỷ lệ VDung dịch B : VDung dịch chuẩn= 4:1 (dung dịch thử). Lọc qua màng lọc 0.45 µm.
3. Hệ thống sắc ký: Máy HPLC được trang bị đèn UV- VIS và cột 4,6 x 250 mm, kích thước hạt 5µm. Tốc độ dòng chảy 1ml/phút. Bước sóng 203nm. Chương trình sắc ký:
Khoảng thời gian (phút) Nồng độ % của ACN
0 25
0-29 47
29-50 47
50-53 80
53-56 25
4. Yêu cầu phù hợp hệ thống: Tiêm lặp lại 6 lần, mỗi lần 15 µL dung dịch chuẩn Rb1 (1mg/ml). Giá trị RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic của chuẩn Rb1 < 2%.
5. Tiến hành: Tiêm dung dịch thử đã chuẩn bị (thể tích tiêm 15 µL). Ghi lại sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu của 14 pic đặc trưng, so sánh với thời gian lưu của chuẩn Rb1. Tính toán giá trị RRT. Các mẫu Giảo cổ lam thu hái tại Đà Lạt có giá trị RRT và phạm vi chấp nhận của 14 pic được trình bày ở bảng sau: Pic TB RRT Sai số chấp nhận Pic TB RRT Sai số chấp nhận Rb1 1 ± 0 8 1.548 ± 0.01 1 0.820 ± 0.01 9 1.595 ± 0.01 2 0.856 ± 0.01 10 1.639 ± 0.01 3 0.882 ± 0.01 11 1.683 ± 0.01 4 0.928 ± 0.01 12 1.747 ± 0.02 5 1.019 ± 0.01 13 1.803 ± 0.04 6 1.076 ± 0.01 14 1.834 ± 0.02 7 1.163 ± 0.01
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Kết luận:
Điều kiện thời gian có hạn và hạn chế về vật lực, nhóm nghiên cứu đã thu được một số kết quả như sau:
1. Đã xây dựng được phương pháp chiết xuất và tinh chế để thu được saponin toàn phần từ dược liệu GCL, cụ thể như sau:
- Chiết siêu âm 3 lần x 10 phút với công suất 40%, sử dụng dung môi EtOH 70%.
- Tinh chế bằng phương pháp chiết lỏng-rắn sử dụng nhựa hấp phụ Diaion
HP-20, rửa giải bằng H2O và MeOH 20% để loại tạp và rửa giải trong khoảng nồng độ MeOH từ 50-80% để thu saponin toàn phần.
2. Đã xây dựng được phương pháp cho phép định tính saponin toàn phần trong GCL bằng phương pháp dấu vân tay trong HPLC các điều kiện cụ thể như sau:
- Thể tích tiêm mẫu: 15 µL.
- Detector UV: bước sóng 203 nm.
- Thời gian chạy: 60 phút. - Tốc độ dòng: 1ml/phút.
- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.
- Hệ dung môi ACN : H20 với chương trình chạy như sau:
Khoảng thời gian (phút) Nồng độ % của ACN
0 25
0-29 47
29-50 47
50-53 80
3. Phương pháp xây dựng đã được thẩm định, kết quả cho thấy các chỉ tiêu đều đạt yêu cầu cho phương pháp định tính bằng HPLC.
4. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để định tính 5 mẫu Giảo cổ lam trồng tại Đà Lạt (ĐL1, ĐL2, ĐL3, ĐL4, ĐL5). Trên cả 5 mẫu đều phân tách được có 14 pic saponin chính chia làm 4 tiểu vùng (A, B, C, D) có thời gian lưu tương đối so với Rb1 lần lượt là 0.820; 0.856; 0.882; 0.928; 1.019; 1.076; 1.163; 1.548; 1.595; 1.639; 1.683; 1.747; 1.803 và 1.834. Đặc điểm sắc ký đồ và thông số RRT và RPA của 14 pic saponin này so với chuẩn Rb1 là vết vân tay đại diện cho vùng trồng dược liệu Giảo cổ lam tại Đà Lạt.
Đề xuất:
Do thời gian có hạn, nội dung khóa luận mới chỉ tiến hành định tính 5 mẫu Giảo cổ lam thu hái tại Đà Lạt nên chưa có tính đại diện cao cho dược liệu Giảo cổ lam tại Việt Nam. Do đó cần tiếp tục nghiên cứu, xây dựng dấu vân tay của Giảo cổ lam, đặc biệt là những vùng trồng có giá trị kinh tế cao, đang được sử dụng với số lượng lớn để làm thuốc, giúp xác thực loài, đánh giá chất lượng và đảm bảo sự thống nhất và ổn định, giúp kiểm soát chất lượng thảo dược GCL và các thuốc có nguồn gốc từ GCL.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Đánh giá độ ổn định về thời gian lƣu tƣơng đối
Pic RRT 0h 2h 6h 8h 12h 24h TB RRT RSD(%) Rb1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0.821 0.818 0.816 0.817 0.819 0.817 1 0.22 2 0.856 0.853 0.852 0.850 0.851 0.858 0.82 0.36 3 0.883 0.882 0.881 0.881 0.882 0.883 0.85 0.10 4 0.928 0.927 0.926 0.927 0.926 0.928 0.88 0.08 5 1.019 1.017 1.018 1.017 1.017 1.018 0.93 0.08 6 1.077 1.078 1.078 1.078 1.078 1.076 1.02 0.07 7 1.165 1.167 1.167 1.166 1.167 1.167 1.08 0.17 8 1.550 1.555 1.554 1.555 1.558 1.553 1.17 0.17 9 1.599 1.603 1.603 1.604 1.607 1.604 1.55 0.16 10 1.643 1.647 1.647 1.649 1.651 1.648 1.60 0.16 11 1.686 1.691 1.690 1.694 1.695 1.690 1.65 0.19 12 1.750 1.755 1.755 1.757 1.758 1.756 1.69 0.16 13 1.783 1.788 1.789 1.792 1.793 1.790 1.76 0.20 14 1.838 1.842 1.842 1.844 1.847 1.841 1.79 0.16
Phụ lục 2. Đánh giá độ ổn định về diện tích pic tƣơng đối
