HPLC
- Phân tích các mẫu GCL của loài G. pentaphyllum thu hái tại Đà Lạt (5 mẫu).
STT Đặc điểm mẫu phân tích
1 Vùng trồng 1, cây 4 tháng, thu hoạch năm thứ nhất
2 Vùng trồng 2, cây 4 tháng, thu hoạch năm thứ nhất
3 Vùng trồng 3, cây 4 tháng, thu hoạch năm thứ nhất
4 Vùng trồng 1, cây 3 tháng, thu hoạch năm thứ nhất
5 Vùng trồng 1, cây 4 tháng, thu hoạch năm thứ hai
- Kết quả thu được xử lý thống kê, phân tích đặc điểm vết vân tay giữa các mẫu nghiên cứu theo hướng dẫn phụ lục XII về “Phân tích vết vân tay sắc ký khí và HPLC”, dược điển Hồng Kông [22].
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ
3.1. CHIẾT XUẤT - TINH CHẾ SAPONIN TOÀN PHẦN TỪ DƢỢC LIỆU.
3.1.1. Chiết xuất.
Chiết 1 g dược liệu Giảo cổ lam bằng phương pháp chiết siêu âm với EtOH 70% (3 lần x 20ml/ lần, thời gian 10 phút, công suất 40%). Gộp dịch chiết, lọc qua bông và giấy lọc. Cô cách thủy đến cắn, hòa tan trong 3 ml nước cất thu được dung dịch A (dd A).
3.1.2. Tinh chế
Khảo sát dung môi rửa giải
Tiến hành khảo sát dung môi rửa giải theo mục 2.3.1. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi rửa giải
STT Dung môi KQ Định tính STT Dung môi KQ định tính 1 H2O - 7 MeOH 60% ++ 2 MeOH 10% - 8 MeOH 70% ++ 3 MeOH 20% - 9 MeOH 80% ++ 4 MeOH 30% + 10 MeOH 90% - 5 MeOH 40% + 11 MeOH 100% -
6 MeOH 50% ++ (-) Âm tính; (+) Dương tính
Kết hợp với kết quả nghiên cứu [26] đưa ra 3 kết luận:
- Lựa chọn nước cất để loại các thành phần không hấp phụ được xác định không phải là saponin. Rửa đến khi hết màu.
- Lựa chọn MeOH 20% để loại các thành phần không hấp phụ được xác định không phải là saponin. Tiến hành rửa giải đến khi hết màu (khoảng 150ml).
- Lựa chọn khoảng rửa giải để thu được saponin toàn phần là MeOH có nồng độ từ 50% đến 80%. Tiến hành rửa giải lần lượt ở từng nồng độ đến khi kiếm tra bằng phản ứng tạo bọt và SKLM không thấy saponin. Chuyển nồng độ mới khi đã rửa kiệt saponin bằng nồng độ cũ. Toàn bộ dịch rửa giải được gộp chung vào cốc có mỏ sạch dung tích 500ml. Cất thu hồi bằng áp suất giảm tới cắn B. Hòa tan hoàn toàn cắn B trong bình định mức 20 ml bằng ACN 25% thu được dung dịch B (dd B).
Khảo sát khả năng loại Chlorophyll của nhựa Diaion HP20.
Kiểm tra khả năng loại tạp màu của dịch trước khi qua cột (1) và dịch sau khi qua cột Diaion HP-20 (2).
Khai triển với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H20 (7:3:0,4). Quan sát sắc ký đồ ở ánh sáng thường và tại bước sóng 366 nm. Các vết chlorophyll có màu xanh ở ánh sáng thường và phát huỳnh quang đỏ tại bước sóng 366 nm.
Nhận xét: Chlorophyll đã bị loại khi qua cột diaion HP-20. Hình 3.1. Sắc ký đồ trƣớc khi qua cột (1) và sau khi qua cột Diaion HP 20 (2)
Khả năng loại Flavonoid của nhựa Diaion HP-20.
Quét phổ dung dịch B trên máy đo quang phổ trong khoảng bước sóng từ 190 – 500nm. Mẫu trắng là dung dịch ACN 25%.
Hình 3.2 cho thấy dung dịch B có cực đại hấp thụ ở khoảng 203 nm. Khu vực bước sóng dài hơn đến khả kiến không thấy hấp thụ mạnh. Chứng tỏ nhựa Diaion HP-20 đã loại được phần lớn Flavonoid trong Giảo cổ lam.
3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành khảo sát với 1 mẫu bất kỳ trong 5 mẫu đã chuẩn bị (Lựa chọn mẫu Đà Lạt 2).
3.2.1. Khảo sát bƣớc sóng
Tiến hành khảo sát với dung dịch chuẩn Rb1 (1 mg/ml) và quét phổ trên máy HPLC Agilent 1200 thu được kết quả sau:
Hình 3.3. Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch chuẩn Rb1 trên máy HPLC
Từ phổ hấp thụ trên có thể thấy dung dịch chuẩn Rb1 cũng hấp thụ cực đại ở bước sóng 203 nm tương ứng với dung dịch B (hình 3.2). Do đó có thể chọn bước sóng này để định tính saponin trong Giảo cổ lam. Ngoài ra khi tiến hành sắc ký các mẫu có thể sử dụng kỹ thuật quét phổ để nhận ra các pic saponin đặc trưng xuất hiện trong dung dịch thử.
3.2.2. Khảo sát hệ dung môi
Tiến hành khảo sát 3 hệ sắc ký được trình bày trong mục 2.3.2. - Thể tích tiêm: 20 µL.
- Tốc độ dòng: 1ml/ phút. - Bước sóng: 203 nm.
Hệ 1: Không có khả năng tách các pic trên sắc ký đồ với phương pháp chạy đẳng dòng ACN : H20 (34:66).
Hệ 3: Không tách được các pic saponin, thời gian phân tích dài.
Hệ 2: Có khả năng tách 1 số pic saponin. Căn cứ vào sắc ký đồ thực tế, điều chỉnh hệ dung môi để tách các pic saponin tốt hơn như sau:
Khoảng thời gian (phút) Nồng độ % của ACN
0 25
0-29 47
29-50 47
50-53 80
53-56 25
Nhận xét: Sắc ký với chương trình chạy như trên có khả năng tách được các
saponin trong Giảo cổ lam nên đây sẽ là chương trình dung môi được lựa chọn để sử dụng trong định tính các saponin trong dược liệu Giảo cổ lam.
3.2.3. Khảo sát thể tích bơm mẫu
Tiến hành sắc ký với những điều kiện đã chọn nhưng với thể tích tiêm mẫu thay đổi: 5 µL, 10 µL, 15 µL, 20 µL.
Ở thể tích tiêm 5µL, 10 µL: Chiều cao pic thấp, khó quan sát, đặc biệt là với các saponin có hàm lượng thấp.
Ở thể tích tiêm 20 µL một số pic không gọn và có hiện tượng kéo đuôi.
Nhận xét: Với thể tích tiêm mẫu là 15 µL có khả năng quan sát các pic tốt
3.2.4. Khảo sát tốc độ dòng
Tiến hành sắc ký với những điều kiện đã chọn nhưng với tốc độ dòng thay đổi: 0.8 ml/phút, 1 ml/ phút, 1.2 ml/phút.
Ở tốc độ 0.8 ml/ phút và 1.2 ml/ phút: Không tách được 1 số pic trên sắc ký đồ.
Nhận xét: tốc độ dòng 1 ml/phút có khả năng tách tốt nhất các pic trên sắc ký
đồ, nên lựa chọn tốc độ này trong phân tích tiếp theo.
Điều kiện sắc ký lựa chọn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ các kết quả khảo sát, tiến hành xây dựng chương trình sắc ký có khả năng tách các saponin trong GCL như sau:
Thể tích tiêm mẫu: 15 µL.
Detector UV: bước sóng 203 nm. Thời gian chạy: 60 phút.
Tốc độ dòng: 1ml/phút.
Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Hệ dung môi ACN : H20 với chương trình sắc ký như sau:
Khoảng thời gian (phút) Nồng độ % của ACN
0 25
0-29 47
29-50 47
50-53 80
Hình 3.4 Sắc ký đồ của các saponin trong GCL (khảo sát điều kiện sắc ký) 3.2.5. Đánh giá chuẩn nội Rb1
Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn Rb1 (1 mg/ ml) với điều kiện sắc ký vừa khảo sát.
So sánh với sắc ký đồ của các saponin trong GCL (Hình 3.4).
Hình 3.5. Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Rb1
Hình 3.5 cho thấy tại thời gian lưu của chuẩn Rb1 (t= 16.425) trong mẫu thử không có pic saponin nào. Do đó có thể sử dụng chuẩn Rb1- một loại saponin có cấu trúc và tính chất tương tự các gypenosid như 1 chất đánh dấu (Marker) để tính toán các thông số đặc trưng như thời gian lưu tương đối (RRT= thời gian lưu của pic thử/ thời gian lưu của pic Rb1) và diện tích pic tương đối (RPA= Diện tích pic của pic thử/ Diện tích pic của pic Rb1).
Chuẩn bị mẫu định tính Giảo cổ lam:
Từ các dữ liệu khảo sát trên, tiến hành chuẩn bị các mẫu phân tích:
- Dung dịch thử: chuẩn bị như mục 2.3.1 được cắn B sau đó hòa tan trong ACN 25% và chuyển vào bình định mức 20ml (Dung dịch B).
- Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/ml.
- Trước khi tiêm mẫu thử vào hệ thống HPLC để phân tích, dung dịch chuẩn Ginsenoside Rb1 được thêm vào dung dịch thử như là một maker theo tỉ lệ VDung dịch B : VDung dịch chuẩn= 4:1. Lọc dung dịch qua màng lọc 0.45 µm.
3.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 3.3.1. Tính phù hợp của hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp chuẩn Rb1 (1mg/ml) và tiến hành chạy với chương trình đã khảo sát. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký
STT Thời gian lƣu (phút) Diện tích pic (mAU*s) 1 16.475 1025.4 2 16.520 1031.2 3 16.473 1036.1 4 16.451 1035.5 5 16.450 1039.2 6 16.442 1032.1 TB 16.469 1033.3 RSD (%) 0.173 0.465
Nhận xét: Kết quả cho thấy RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic của
chuẩn Ginsenosid Rb1 đối với 6 phép thử < 2%. Điều này chứng tỏ hệ thống phù hợp cho việc định tính các saponin trong GCL.
3.3.2. Độ ổn định
Tiêm mẫu tại các thời điểm: 0h, 2h, 6h, 8h, 12h, 24h.
Tính trung bình RRT và RPA của các pic ở 6 thời điểm trên (Bảng 3.3). RRT = Thời gian lưu của các pic saponin / Thời gian lưu của pic Rb1. RPA = Diện tích pic của pic saponin / Diện tích pic của pic Rb1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ ổn định của quy trình phân tích
Pic RRT (TB của 6 thời điểm) RSD (%) RPA (TB của 6 thời điểm) RSD (%) Rb1 1 0 1 0 1 0.82 0.22 0.33 2.39 2 0.85 0.36 0.28 1.16 3 0.88 0.10 0.12 3.02 4 0.93 0.08 0.07 3.86 5 1.02 0.08 0.05 7.11 6 1.08 0.07 0.46 2.09 7 1.17 0.17 0.67 1.23 8 1.55 0.17 0.64 1.52 9 1.60 0.16 1.44 0.96 10 1.65 0.16 0.63 1.44 11 1.69 0.19 1.12 0.77 12 1.76 0.16 0.04 3.39 13 1.79 0.20 0.08 4.99 14 1.84 0.16 0.06 5.82 Nhận xét:
- Thông số RRT (Thời gian lưu tương đối): Giá trị RSDRRT của tất cả 14 pic saponin đặc trưng ≤ 0.36 %. Chứng tỏ phương pháp có độ ổn định trong 24h.
- Thông số RPA (Diện tích pic tương đối): Trong 14 pic saponin đặc trưng có 12 pic saponin có giá trị RSDRPA < 5%. Có 2 pic saponin số 5, 14 có giá trị RSDRPA > 5%. Có thể do 2 saponin này có hàm lượng rất thấp, ảnh hưởng của đường nền khiến việc xác định diện tích pic chưa chính xác.
3.3.3. Độ lặp lại
Tiến hành phân tích 6 phép thử song song của cùng 1 mẫu thử (Cùng quy trình chiết xuất - tinh chế và xử lý mẫu).
Đánh giá thông số RRT các pic saponin đặc trưng, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình phân tích
Pic RRT (TB của 6 mẫu) RSD (%) Pic RRT (TB của 6 mẫu) RSD (%) Rb1 1 0 8 1.55 0.1 1 0.82 0.34 9 1.59 0.11 2 0.86 0.18 10 1.64 0.11 3 0.88 0.09 11 1.68 0.12 4 0.93 0.06 12 1.74 0.13 5 1.02 0.08 13 1.79 0.62 6 1.08 0.07 14 1.83 0.14 7 1.16 0.05 Nhận xét:
Giá trị RSDRRT của tất cả 14 pic saponin đặc trưng ≤ 0.62 %. Chứng tỏ phương pháp chiết xuất - tinh chế và xử lý các mẫu có độ lặp lại tốt.
3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC MẪU GCL THU HÁI TẠI ĐÀ LẠT
Sử dụng phương pháp phân tích như trên lần lượt cho 5 mẫu khác nhau, kết quả thu được như sau:
Mẫu ĐL1: vùng trồng 1, cây 4 tháng thu hái năm đầu
Mẫu ĐL2: vùng trồng 2, cây 4 tháng thu hái năm đầu
Mẫu ĐL3: vùng trồng 3, cây 4 tháng thu hái năm đầu
Mẫu ĐL4: vùng trồng 1, cây 3 tháng thu hái năm đầu
Mẫu ĐL4: vùng trồng 1, cây 4 tháng thu hái năm thứ 2
Hình 3.6. Sắc ký đồ của 5 mẫu GCL
Kết quả sắc ký đồ của 5 mẫu Giảo cổ lam được trồng và thu hái tại Đà Lạt cho thấy có 14 pic saponin (Đánh số từ 1 đến 14). 14 pic này xuất hiện
đồng thời ở cả 5 mẫu (3 vùng trồng, thu hái trong các thời điểm khác nhau), có khoảng tin cậy về RRT các mẫu cao (bảng 3.5).
Bảng 3.5. Khoảng tin cậy (95%) của 5 mẫu GCL thu hái tại Đà Lạt
Pic TB RRT của 5 mẫu Khoảng tin cậy 95% Pic TB RRT của 5 mẫu Khoảng tin cậy 95% Rb1 1 ± 0 8 1.548 ± 0.007 1 0.820 ± 0.005 9 1.595 ± 0.006 2 0.856 ± 0.004 10 1.639 ± 0.010 3 0.882 ± 0.002 11 1.683 ± 0.009 4 0.928 ± 0.001 12 1.747 ± 0.010 5 1.019 ± 0.002 13 1.803 ± 0.036 6 1.076 ± 0.002 14 1.834 ± 0.011 7 1.163 ± 0.003 Nhận xét:
- Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn, kết hợp với kỹ thuật quét phổ xác nhận được trong các mẫu Giảo cổ lam tại Đà Lạt có 14 pic saponin đặc trưng.
- Hình dạng sắc ký tương đồng giữa các mẫu. Khả năng phân tách tốt.
- Các saponin phân bố tâp trung trong khoảng thời gian từ 13.5 phút đến 30.5 phút theo chương trình sắc ký đã chọn.
3.5. BÀN LUẬN
Về phƣơng pháp chiết xuất và tinh chế mẫu
Để định tính saponin toàn phần trong GCL cho kết quả hợp lý và đáng tin cậy, trước hết cần phương pháp chiết xuất và tinh chế tối ưu.
Chiết siêu âm với dung môi EtOH 70%. Đây là phương pháp dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhanh chóng, sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, không độc hại, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt và cho hiệu suất chiết cao.
Tinh chế sử dụng phương pháp chiết pha rắn sử dụng nhựa hấp phụ Diaion HP-20, rửa giải bằng MeOH trong khoảng nồng độ từ 50-80%. Đây là phương pháp có độ lặp lại tốt, quy trình đơn giản, dễ thực hiện, sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, loại được nhiều tạp chất mà không làm hao hụt saponin. Về khảo sát điều kiện sắc ký và thẩm định phƣơng pháp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dựa trên các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát cực đại hấp thụ và các điều kiện chạy sắc ký theo mục 3.2. Xác định được bước sóng hấp thụ cực đại, lựa chọn được các điều kiện chạy sắc ký tối ưu.
Sau khi xây dựng một quy trình định tính, để áp dụng quy trình vào thực tế một cách chính xác, cho kết quả tin cậy, cần thẩm định lại phương pháp theo quy định chung. Phương pháp phân tích đã được thẩm định dựa trên tính tương thích, độ ổn định của hệ thống và độ lặp lại đủ điều kiện để sử dụng phân tích định tính các saponin trong Giảo cổ lam tại Việt Nam.
Định tính xác định dấu vân tay bằng HPLC đối với dƣợc liệu Giảo cổ
lam
Giảo cổ lam (G. pentaphyllum) là một loại thuốc khá thông dụng trên thế giới; Dược điển Hồng Kông đã giới thiệu chuyên luận về Giảo cổ lam. Thành phần hoạt chất chính là saponin trong Giảo cổ lam rất phức tạp và hiện vẫn chưa có phương pháp HPLC nào định lượng được công bố. Phương pháp định tính sử dụng các đặc điểm sắc ký đồ HPLC làm vết vân tay giúp việc kiểm soát chất lượng giảo cổ lam hiệu quả hơn. Một khó khăn nữa là các chất
chuẩn, maker saponin trong Giảo cổ lam khó phân tách và chưa được thương mại. Việc lựa chọn Rb1 làm chuẩn nội rất có ý nghĩa vì có cấu trúc và tác dụng tương đồng, hơn nữa Rb1 khá thông dụng để làm maker [18].
A B C D
Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC bốn tiểu vùng A, B, C, D saponin trong GCL
Sắc ký đồ các saponin của 5 mẫu Giảo cổ lam thu tại Đà Lạt khá thống nhất (hình 3.6). Các mẫu 1, 4, 5 trồng tại vùng trồng 1 cho pic của 14 saponin rất rõ ràng, trong đó mẫu 5 thu được ở năm trồng thứ 2 là tốt nhất. Mẫu 1 và 4 không khác nhau nhiều cho thấy lượng saponin thu hoạch 3 tháng và 4 tháng
như nhau; nhưng thực tế vẫn thu hoạch ở tháng thứ 4 do cây sinh ra lượng sinh khối lớn hơn nhiều.
Sắc ký đồ HPLC các saponin trong dược liệu Giảo cổ lam cho 14 pic saponin, có thể chia thành 4 tiểu vùng A, B, C, D. Tiểu vùng A, B, C có 11 pic khá rõ ràng, hàm lượng tương đối lớn; riêng tiểu vùng D có 3 pic 12, 13, 14 hàm lượng thấp. Khi phân tích cùng điều kiện sắc ký với các mẫu thu hái mọc hoang tại Sapa (Lào Cai), Hòa Bình, Tam đảo (Vĩnh Phúc) có thể nhận thấy vùng C (pic 8, 9, 10, 11) là vùng đặc hiệu cho tất cả các mẫu G. pentaphyllum và đặc trưng cho Giảo cổ lam tại Việt Nam.