21
Khảo sát hệ dung môi phân tích:
Một số hệ dung môi sau đã được khảo sát để khai triển phân đoạn ethylacetat: n-butanol – acid acetic – nước (7 : 4 : 2)
Chloroform – ethyl acetat (1 : 1,5)
Cloroform – ethyl acetat – acid acetic (5 : 7,5 : 0,1).
Qua quá trình khảo sát, nhận thấy trong số các hệ dung môi này chỉ có hệ dung môi: Cloroform – ethyl acetat – acid acetic (5 : 7,5 : 0,1) cho khả năng phân tách tốt nhất. Do đó hệ này được lựa chọn để phân tích phân đoạn ethyl acetat. Các điều kiện khai triển sắc ký như sau:
- Bản mỏng tráng sẵn TLC silica gel 60 F254.
- Hệ dung môi khai triển: cloroform-ethylacetat-acid acetic(5:7,5:0,1)
- Dung dịch thử: dịch chiết cồn 70% của các dược liệu cỏ lưỡi rắn, đan sâm, hồng hoa, trâu cổ, ngưu tất, thương truật, ý dĩ, hoàng bá và dịch chiết phân đoạn ethylacetat.
- Dung dịch chất đối chiếu: Tanshinon IIA 0,2mg/ml trong methanol, acid ursolic 0,2mg/ml trong methanol.
- Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng (chiều dài 10cm) 3µl chất đối chiếu và 5µl mỗi dung dịch thử của tán phòng hoa nhĩ thảo, hồng hoa,trâu cổ, ngưu tất, thương truật, ý dĩ, đan sâm, 2 µl hoàng bá và 6 µl phân đoạn ethylacetat. Sau khi khai triển, để khô bản mỏng ngoài không khí rồi hiện màu bằng thuốc thử NP/PEG và sấy ở 1100C.
22
Hình 3.2. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết phân đoạn ethylacetat bài thuốc so sánh với dịch chiết các dược liệu thành phần khi quan sát dưới ánh sáng thường (A), ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm (B), 366 nm (C), sau khi hiện màu bằng thuốc thử NP/PEG dưới UV 366 nm (D).
Nhận xét:
- Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng thường chỉ thấy vết Tanshinon IIA màu hồng có giá trị Rf bằng 0,70 tương ứng với vết trên sắc ký đồ của ĐS. Tuy nhiên sắc ký đồ phân đoạn ethylacetat với thể tích chấm này chỉ cho 1 vết rất mờ có giá trị Rf
tương ứng.
- Dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm nhận thấy dịch chiết phân đoạn ethylacetat có ít nhất 6 vết chất phân tách rõ. Trong đó có 3 vết chất có giá trị Rf
23
bằng 0,69; 0,53; 0,48 tương ứng với các vết có mặt trong dịch chiết TT; 1 vết có giá trị Rf bằng 0,27 tương ứng với vết có mặt trong dịch chiết cỏ lưỡi rắn.
- Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm nhận thấy sắc ký đồ phân đoạn có nhiều vết chất có huỳnh quang trong đó đáng chú ý sự có mặt của 2 vết chất huỳnh quang xanh (Rf = 0,58; 0,40), 2 vết chất có huỳnh quang đỏ (Rf = 0,17; 0,28), 1 vết chất huỳnh quang tím nhạt có Rf =0,27 tương ứng với các vết chất trên sắc ký đồ dịch chiết CLR. Ngoài ra còn sự xuất hiện đáng chú ý của vết chất có huỳnh quang vàng có Rf = 0,50 tương ứng với vết chất có mặt trong dịch chiết TC.
- Sau khi phun thuốc thử NP/PEG và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm các vết chất có huỳnh quang hầu như không thay đổi ngoại trừ vết màu tím nhạt có Rf bằng 0,27 có huỳnh quang sáng hơn. Các vết của dịch chiết HH cũng có huỳnh quang sáng lên. Tuy nhiên tương ứng với các vùng này không quan sát được trên sắc ký đồ phân đoạn ethylacetat. Như vậy có thể thấy rằng việc sử dụng thuốc thử NP/PEG trong trường hợp này ít có ý nghĩa do đó chúng tôi quyết định chuyển sang thuốc thử hiện màu là anisaldehyd – acid sulfuric.
Sử dụng hệ dung môi : Chloroform – ethylacetat (1 : 1,5), sắc ký đồ thu được trình bày ở hình 3.3.
Kết quả sắc ký đồ ở ánh sáng thường, UV 254 nm, UV 366 nm thu được tương tự với hệ dung môi trên. Sau khi phun thuốc thử hiện màu trên sắc ký đồ cho 2 vết màu tím đặc trưng, tuy nhiên không cho phép nhận biết thêm bất cứ dược liệu thành phần nào.
Như vậy trong điều kiện sắc ký này, việc sử dụng thuốc thử hiện màu không thực sự cần thiết.
24
Trong điều kiện khai triển sắc ký này không quan sát thấy rõ sự có mặt của Tanshinon IIA, do đó để nhận biết sự có mặt của Tanshinon IIA trong bài thuốc điều kiện sắc ký được triển khai như sau:
Hình 3.3. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết phân đoạn ethylacetat bài thuốc so sánh với các dược liệu thành phần khi quan sát dưới ánh sáng thường (A), ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm (B) và 366 nm (C), sau khi phun thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric dưới ánh sáng thường (D), dưới UV 366 nm (E).
25
- Bản mỏng TLC silicagel 60 F254.
- Hệ dung môi khai triển: Toluene-ethylacetat (19:1)
- Dung dịch thử: dịch chiết cồn 70% đan sâm và dịch chiết phân đoạn ethylacetat.
- Dung dịch chất đối chiếu: dung dịch Tanshinon IIA 0,2mg/ml trong methanol.
- Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng (dài 10cm) 3µl chất đối chiếu và 5µl đan sâm, và 6µl phân đoạn ethylacetat. Sau khi khai triển, để khô bản mỏng ngoài không khí, quan sát dưới ánh sáng tự nhiên rồi phun thuốc thử hiện màu là anisaldehyd – acid sulfuric và sấy ở 110 0 C.
- Kết quả sắc ký đồ được trình bày ở hình 3.4.
Nhận xét: Trên hình ảnh sắc ký đồ có thể thấy rõ sự có mặt của Tanshinon
26
Hình 3.4. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết phân đoạn ethylacetat, Tanshinon IIA, đan sâm khi quan sát dưới ánh sáng thường (A), ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm (B), 366 nm (C), sau khi phun thuốc
thử anisaldehyd-acid
sulfuric dưới ánh sáng thường (D) và dưới UV 366 nm (E).
27