Khảo sát hệ dung môi phân tích:
Một số hệ dung môi sau đã được khảo sát để khai triển phân đoạn n-hexan: Chloroform - ethylacetat (19 :1).
Cloroform - ethylacetat - acid acetic (19 : 1 : 0,1). Chloroform - ethylacetat - acid acetic (30 : 0,5 : 0,05).
Ether dầu (60-90) - ethylacetat - acid acetic với các tỷ lệ khác nhau là (10:3:0,1) và (7 : 3 : 0,1).
Qua quá trình khảo sát ban đầu nhận thấy trong số các hệ dung môi khảo sát chỉ có hệ dung môi: ether dầu (60-90) – ethylacetat - acid acetic (7 : 3 : 0,1) có khả năng phân tách tốt nhất. Do đó hệ này được lựa chọn để phân tích phân đoạn n- hexan. Các điều kiện khai triển sắc ký như sau:
18
- Hệ dung môi khai triển: ether dầu (60-90) – ethylacetat - acid acetic (7 : 3 : 0,1).
- Dung dịch thử: dịch chiết cồn 70% của các dược liệu là cỏ lưỡi rắn (CLR), đan sâm (ĐS), hồng hoa (HH), trâu cổ (TC), ngưu tất (NT), thương truật (TT), ý dĩ (YD), hoàng bá (HB) và dịch chiết phân đoạn n-hexan.
- Dung dịch chất đối chiếu: Tanshinon IIA 0,2mg/ml trong methanol và acid ursolic 0,2mg/ml trong methanol.
- Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng (chiều dài 10cm) 3µl chất chuẩn và 5µl mỗi dung dịch thử từng dược liệu, 2µl hoàng bá và phân đoạn n-hexan chấm riêng 2 vết là 1µl, 0,2µl. Sau khi khai triển, để khô bản mỏng ngoài không khí rồi hiện màu bằng thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric và sấy ở 110oC trong 5 – 10 phút.
19
Hình 3.1Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết phân đoạn n-hexan bài thuốc so sánh với dịch chiết các dược liệu thành phần khi quan sát lần lượt dưới ánh sáng thường (A), ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm (B), 366 nm (C), sau khi phun thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric dưới ánh sáng thường (D) và dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm (E).
20
Nhận xét: - Dưới ánh sáng thường chỉ quan sát thấy 1 vết màu hồng có giá trị
Rf bằng 0,58 của chất chuẩn Tanshinon IIA tương ứng với 1 vết trên sắc ký đồ của đan sâm, vết chất này không thấy trong phân đoạn n-hexan của bài thuốc.
- Dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm có thể quan sát thấy rõ vết chất Tanshinon IIA. Ở bước sóng này có thể quan sát thấy một số vết chất của các dược liệu: CLR, ĐS, HH, TC, TT. Tuy nhiên trên sắc ký đồ dịch chiết phân đoạn n-hexan bài thuốc hầu như không quan sát thấy vết chất, ngoại trừ 1 vết có giá trị Rf bằng 0,46 tương ứng với vết chất có mặt trong sắc ký đồ của dịch chiết TT.
- Dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm có thể quan sát thấy 1 số vết chất của các dược liệu CLR, ĐS, TC, TT. Dịch chiết phân đoạn n-hexan có 4 vết cho huỳnh quang màu xanh, trong đó có thể nhận biết được vết huỳnh quang xanh có giá trị Rf bằng 0,27 tương ứng với vết chất có mặt trong dịch chiết của CLR và vết huỳnh quang xanh có Rf bằng 0,12 tương ứng trong dịch chiết ĐS.
Như vậy dưới ánh sáng thường và ánh sáng tử ngoại không quan sát được sự có mặt của acid ursolic.
-Sau khi phun thuốc thử hiện màu là anisaldehyd – acid sulfuric, acid ursolic cho vết chất màu tím khi quan sát dưới ánh sáng thường (Rf = 0,34), dưới ánh sáng tử ngoại vết này có màu vàng đặc trưng có thể nhận thấy rõ trong phân đoạn n- hexan của bài thuốc và trong dịch chiết CLR. Quan sát sắc ký đồ phân đoạn n-hexan bài thuốc nhận thấy ít nhất sự có mặt của 5 vết chất trong đó có 1 vết màu tím đậm và diện tích lớn có giá trị Rf bằng 0,45. Hầu hết các dược liệu đều xuất hiện vết chất có giá trị Rf tương ứng. Ngoài ra còn có 3 vết chất khác có Rf tương ứng với các vết có trong TT (Rf = 0,52; 0,59; 0,64).
Tóm lại: Với hệ dung môi khai triển này, sắc ký đồ của phân đoạn n-hexan cho ít nhất 5 vết chất đặc trưng sau khi phun thuốc thử hiện màu. Kết hợp với kết quả SKĐ quan sát được ở bước sóng 254 nm và 366 nm cho phép sơ bộ kết luận sự có mặt của acid ursolic, cỏ lưỡi rắn và thương truật trong bài thuốc, không nhận biết được sự có mặt của Tanshinon IIA trong phân đoạn n-hexan.