- Tính chất của BL1: Là chất có dạng tinh thể màu trắng, có nhiệt độ nóng chảy là 2100C - 2130C, không hiện UV trên SKLM, hiện màu hồng tím sau khi phun dung dịch H2SO4 10% trong cồn và hơ nóng trên bếp điện.
- BL1 sau khi đã tinh chế đƣợc đem đo các phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR), khối phổ (ESI-MS) để xác định cấu trúc.
- Phổ IR (Xem phụ lục 2) cho thấy hợp chất BL1 có hấp thụ của nhóm OH ở vùng 3314,48 cm-1, CH ở vùng 2954,06 cm-1, ở vùng 1640,27 và 1461,91 cm-1 đắc trƣng cho liên kết C=C. Phổ 1
H-NMR và 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT đã xác định đƣợc hợp chất BL1 có 30 carbon. Phổ khối ghi theo chế độ ESI (+) (xem phụ lục 3) cho pic phân tử [M]+ = 427,0. Từ các dữ liệu phổ 13C và ESI- MS cho phép xác định công thức phân tử chất này là C28H58O, (giá trị phổ khối
theo tính toán 426,8). Đây là một triterpen có 5 vòng cùng với một liên kết đôi trong phân tử.
+Trên phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của chất BL1 xuất hiện tín hiệu đặc trƣng cho hydroxy methin C-3 (δH 3,21, 1H, m). 7 tín hiệu singlet đặc trƣng cho 7 nhóm methyl (δH 0,76; 0,78; 0,87; 0,94; 0,96; 1,03; 1,56), thêm vào đó sự có mặt của nhóm methin olefinic thể hiện qua tín hiệu ở δH 4,68 ppm (1H, d, J = 1,8 Hz, H-29a) và δH 4,56 ppm (1H, q, J = 1,8 Hz, H-29a). cho ta các giả thuyết về một phần cấu trúc đặc trƣng cho triterpen khung lupan.
+ Trên phổ 13C-NMR có các tín hiêu đặc trƣng δC = 151,0 ppm đặc trƣng cho C-20, δC = 109,3 ppm đặc trƣng cho C-29, δC = 79,0 ppm đặc trƣng cho nhóm C-3. Phân tích phổ C13 và phổ DEPT cho thấy hợp chất BL1 có 30 carbon, trong đó có 6 nhóm CH, 11 nhóm CH2, 7 nhóm CH3, 6 carbon bậc 4. Dựa trên những kết quả thu đƣợc từ những dữ liệu phổ 1H và 13C – NMR, phổ khối, phổ IR của hợp chất phân lập đƣợc kết hợp so sánh với tài liệu đã công bố về hợp chất lupeol có cơ sở để khẳng định chất BL1 đƣợc xác định là 3α-hydroxy-lup- 20(29)-en hay lupeol [3], [18].
H HO H H 29 30 20 19 21 28 17 16 15 27 14 13 12 11 9 18 8 26 7 6 5 4 23 24 3 2 1 10 25 22
Hình 3.15. Công thức cấu tạo của lupeol
Vị trí Phổ NMR của BL1 ( CDCl3) Phổ NMR của lupeol [3], [18] δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) C-1 38,1 38,7 C-2 25,2 1,61 ( 3H, s) 27,5 C-3 79,4 3,2 (1H, m) 79,0 3,18 (1H, dd, J = 4,8 and 11, 6 Hz) C-4 38,7 38,9 C-5 55,3 0,68 (1H, d) 55,3 0,68 (d, 1H, J = 9,5 Hz) C-6 18,3 1,38 ( 1H, q) 18,3 C-7 34,3 34,3 C-8 40,9 40,9 C-9 50,5 1,21 (1H, s) 50,4 C-10 37,2 37,2 C-11 20,9 1,52 (1H, d) 21,0 C-12 27,5 1,25 (1H, d) 25,2 C-13 38,9 1,65 (1H, t) 38,1 C-14 42,9 1,42 ( 1H, d) 42,9 C-15 28,0 1,08 (1H, d) 27,5 C-16 35,6 35,6 C-17 43,0 43,0 C-18 48,3 48,0 C-19 48,0 2,38 (1H, m) 48,3 2,35 (1H, dt, J = 11; 5,5 Hz) C-20 151,0 150,9 C-21 29,9 1,93 (1H, m) 1,33 ( 1H, s) 29,7 1,87–1,96 (m)
C-22 40,0 40,0 C-23 29,1 1,15 ( 1H, s) 1,03 (3H, s) 28,0 0,97 (3H, s) C-24 15,4 15,4 0,76 (s, 3H) C-25 16,1 0,94 (3H, s) 16,0 0,83 (3H, s) C-26 16,0 16,1 1,03 (3H,s) C-27 14,6 0,96 (3H, s) 14,6 0,95 (3H, s) C-28 18,0 0,83 ( 3H, s) 18,0 0,79 (3H, s) C-29 109,3 4,68 (1H, d, J = 1,8 Hz) 4,57 (1H, q, J = 1,8Hz) 109,3 4,57 (1H, br s) 4,69 (1H, br s) C-30 19,3 1,68 (3H, s) 19,3 1,66 (3H, s) 3.3.4.2. Chất BL2
- Tính chất: Tinh thể hình kim không màu, điểm nóng chảy 1680C - 1690C, tan trong chloroform, không tan trong methanol, không hấp thụ ánh sáng UV. Trên sắc ký bản mỏng, sau khi phun dung dịch H2SO4 10% trong cồn và hơ nóng trên bếp điện thấy hợp chất này có màu hồng tƣơi rồi xanh tím dần dần.
- Sau khi chấm so sánh β-sitosterol chuẩn lƣu tại khoa Hóa thực vật- Viện Dƣợc liệu. Kết quả ghi nhận trên sắc ký đồ cho thấy thời gian lƣu của hợp chất BL2 và hợp chất β-sitosterol giống nhau (Rf =0,54) trên sắc ký đồ của SKLM với hệ dung môi n-hexan: aceton (2:1) nên kết luận BL2 là hợp chất β-sitosterol. Do đó chúng tôi không tiến hành đo và giải phổ hợp chất BL2.
Hình 3.16. Sắc kí đồ của BL2 và β-sitosterol trên SKLM
3.3.4.3. Chất BL3
- Tính chất: Là chất bột màu trắng, tan trong cloroform, aceton, hấp thụ ánh sáng UV ở bƣớc sóng 254nm trên SKLM, hiện màu hồng tím sau đó chuyển sang màu tím sau khi phun TT H2SO4 10% trong cồn và hơ nóng trên bếp điện.
- Do thời gian có hạn nên chúng tôi chƣa xác định đƣợc cấu trúc hợp chất BL3.
BÀN LUẬN
Về mục đích chọn đề tài
Nấm tỏa dƣơng là một dƣợc liệu quý có tác dụng sinh học rất tốt nhƣng trong nƣớc chƣa có một nghiên cứu nào về dƣợc liệu này đặc biệt là các nghiên cứu về thành phần hóa học. Do vậy nhóm tác giả đề xuất tên của đề tài này là:“
Bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Tỏa dƣơng (Balanophora laxiflora Hemsl.)”. Những kết quả thu nhận đƣợc trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này chỉ là những nghiên cứu ban đầu về thành phần hóa học của nấm tỏa dƣơng, tạo nền móng cho các nghiên cứu sâu hơn về loại dƣợc liệu này.
Về đặc điểm thực vật của nấm tỏa dƣơng
Nấm tỏa dƣơng có các đặc điểm thực vật học rất đặc trƣng nhƣng vẫn có khả năng nhầm lẫn với 1 số cây khác nhƣ Dó đất hình cầu, Dó đất cúc phƣơng, Sơn Dƣơng, Dó đất. Năm loại dƣợc liệu này đều có ở Việt Nam. Mô tả đặc điểm thực vật của nấm tỏa dƣơng nhằm phân biệt rõ ràng tránh nhầm lẫn với các loại dƣợc liệu vừa kể trên.
Một số đặc điểm đặc trƣng của nấm tỏa dƣơng nhằm phân biệt với 4 loài cùng chi với nấm tỏa dƣơng có mặt ở Việt Nam là [2]:
- Củ hình trứng, bề mặt có mụn hình sao nổi rõ.
- Thân khí sinh mang 5-10 lá dạng vẩy ở phần gốc, phiến lá hình mác, cỡ 2-2,5 x 1-1,5 cm.
- Hoa đơn tính khác gốc, họp thành bông nạc. Cụm hoa đực hình trụ, gồm những hoa gần nhƣ không cuống; bao hoa gồm 6 mảnh, trong đó có 2 mảnh giữa (đối diện nhau) lớn hơn và cụt đầu, các mảnh bên hình trái xoăn tròn đầu; khối phấn bị ép ngang (hình ảnh 2.1)
Về việc giám định tên loài thực vật
Giám định mẫu nấm tỏa dƣơng đƣợc thực hiện ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Việc giám định tên nhằm khẳng định chắc chắn rằng đối tƣợng mà chúng tôi nghiên cứu là nấm tỏa dƣơng (Balanophora laxiflora Hemsl.).
Về thành phần hóa học
Chúng tôi đã xác định đƣợc trong nấm tỏa dƣơng có sự có mặt của các nhóm chất gồm: flavonoid, coumarin, tannin, acid hữu cơ, acid amin, chất béo, sterol. Từ kết quả định tính này cho thấy đƣợc phân đoạn n-hexan mà chúng tôi
chọn tách sẽ có sự có mặt tập trung của nhóm chất béo, sterol và các triterpen mà chúng tôi đã tách đƣợc.
Về chiết xuất
Lựa chọn phƣơng pháp chiết nóng với dung môi EtOH 800, đây là dung môi có khả năng chiết đƣợc hầu hết các hoạt chất trong thực vật, rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hại, sôi ở nhiệt độ cao nên phù hợp với pháp chiết nóng. Chiết nóng ở 800
C có ƣu điểm là làm tăng tốc độ khuếch tán trong quá trình chiết xuất, nên làm tăng lƣợng chất khuếch tán; do đó, có thể chiết kiệt hoạt chất và tiết kiệm đƣợc thời gian.
Về phân lập chất
Qua quá trình khảo sát sơ bộ trên SKLM ở phân đoạn n-hexan nhận thấy phân đoạn này có nhiều vết đậm, có các giá trị Rf thích hợp để phân lập các hợp chất.
Phân đoạn n-hexan phân lập đƣợc ba hợp chất gồm lupeol, β-sitosterol, và BL3 bằng cách sử dụng các phƣơng pháp SKLM, sắc ký cột pha thƣờng. Cấu trúc của hợp chất BL1 đƣợc xác định dựa trên dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân, phổ IR, phổ khối lƣợng phân tử có so sánh với dữ liệu phổ đã đƣợc công bố về hợp chất lupeol. Hợp chất BL2 có giá trị Rf tƣơng ứng với hợp chất β-sitosterol khi chấm đối chiếu trên SKLM, do vậy chúng tôi không tiến hành đo phổ mà kết luận hợp chất BL2 là β-sitosterol. Hợp chất BL3 đang đo phổ và hiện tại chƣa có dữ liệu phổ để xác định cấu trúc.
Lupeol có đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn, chống lại các động vật đơn bào- nguyên sinh, chống ung thƣ, ngăn ngừa ung thƣ, đặc biệt là ung thƣ da và tuyến tiền liệt đang cho kết quả thử nghiệm khả quan [11], [17].
β-Sitosterol là một hợp chất rất phổ biến trong thiên nhiên tìm thấy trong nhiều loài thực vật nhƣ Nigella sativa, Serenoa repens, Cucurbita pepo, Pygeum
africanum…[6]. β- sitosterol làm giảm cholesterol máu, tăng sản tuyến tiền liệt lành tính [9].
Chất BL3 hợp chất này do thời gian có hạn nên chúng tôi chƣa có điều kiện đo phổ và giải phổ. Chất này sẽ đƣợc nghiên cứu trong những đề tài tiếp theo.
Đây là nghiên cứu đầu tiên về nấm tỏa dƣơng ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu tạo điều kiện cho các đề tài nghiên cứu sau này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau quá trình thực hiện khóa luận, chúng tôi đã thu đƣợc một số kết quả sau:
- Xác định đƣợc trong nấm Tỏa dƣơng có mặt của các nhóm chất: flavonoid, coumarin, tannin, acid hữu cơ, acid amin, chất béo, sterol.
- Từ phân đoạn n-hexan nấm Tỏa dƣơng phân lập đƣợc 03 hợp chất màu trắng từ các phân đoạn I3, I4, I7. Sử dụng các phƣơng pháp phổ (IR, MS, 1H-NMR, 13C- NMR) và so sánh với các dữ liệu phổ đƣợc công bố, chúng tôi đã xác định đƣợc cấu trúc của BL1 là lupeol. So sánh với chất đối chiếu do viện cung cấp bằng SKLM xác định đƣợc BL2 là β-sitosterol. Chất BL3 chƣa xác định cấu trúc.
Kiến nghị
- Xác định cấu trúc của hợp chất BL3.
- Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của nấm tỏa dƣơng ở phân đoạn n-hexan và các phân đoạn khác và tiến hành thử tác dụng sinh học của các hợp chất tách đƣợc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT.
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr.555-556.
2. Nguyễn Tiến Bân cùng cộng sự (2007), Sách đỏ Việt Nam, phần II. Thực Vật, NXB Khoa học Tự Nhiên và Công Nghệ, Tr.127.
3. Võ Văn Chi ( 2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 1, NXB Y Học, tr. 803. 4. Phạm Hoàng Hộ (2004), Cây cỏ Việt Nam, tập 2, NXB trẻ, Tr 140-141.
5. Lê Thanh Phƣớc, Từ Minh Tỏ (2012), “Góp phần khảo sát thành phần hóa học của vỏ rễ Bần (Sonneratia caseolaris L.)”, Tạp chí Khoa học, (21a), tr 129-133. 6. Nguyễn Quốc Toản (2012), “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của cây Mạ Mân Aganope balansae (Gagnep) Phan Ke Loc, Fabaceae”, luận án tiến sỹ, Viện dƣợc liệu.
7. Bộ môn Dƣợc liệu (2004), Bài giảng Dược liệu, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, tập I.
8. Bộ môn Dƣợc liệu (2006), Thực tập dược liệu, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, phần hóa học.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH.
9. Berges et al. (1995), "Randomised, placebo-controlled, double-blind clinical trial
of β-sitosterol in patients with benign prostatic hyperplasia. β-sitosterol study
group", Lancet 345 (8964), pp. 1529–1532.
10. She G-M, Zhang Y-J, Yang C-R (2009), “Phenolic constituents from
Balanophora laxiflora with DPPH radical- scavenging activity”, Chemmistry and biodiversity, 6, pp. 875-880.
11. Margareth B. C. Gallo, Miranda J. Sarachine (2009), “Biological Activities of Lupeol”, International Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences 3, (1), pp. 46-66.
12. Fotie J, Bohle D. S, Leimanis M. L, Georges E., Rukunga G., Nkengfack A. E. (2006), “Lupeol long-chain fatty acid esters with antimalarial activity from holarrhena floribunda”, J. Nat. Products, 69, pp. 62-67.
13. Forster J. R, Forster G. (2003), “Balanophora”, Flora of China 5, pp. 272-276. 14. Ho S. T, Tung Y. T, Huang C. H, Kuo C. L, Lin C. C, Yang S. C, Wu J. H, “The hypouricemic effect of Balanophora laxiflora extracts and derived phytochemicals in hyperuricemic mice”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012, 2012: 91052.
15. Takhtajan A (2009), Flowering plants, Springer, pp 871.
16. Wang X. H., Liu Z. Z., Qiao W.L., Cheng R, Liu B., She G. (2012), “Phytochemicals and biological studies of plants from the genus Balanophora”,
Chemistry Central Journal, 6(79).
17. Wu T. S., Chen Y. F., Ching C., Wu C. R., Hsieh W. T., Tsai H. Y. (2012), “Balanophora spicata and lupel acetate possess antinociceptive and anti- inflammatory activities in vivo and in vitro”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 273-371.
TRANG WEB
18.http://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BB%8D_D%C3%B3_%C4%91%E1%BA %A5t
PHỤ LỤC
