2.3.1. Nghiên cứu thực vật
Mẫu dƣợc liệu tƣơi (có đủ tiêu chuẩn để định loài gồm có: cơ quan sinh sản, cơ quan sinh dƣỡng và các thông tin ghi chép tại thực địa). Mẫu tƣơi đƣợc thu hái tự nhiên tại Cao Bằng sau đó đƣợc gửi sang Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học.
2.3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong nấm tỏa dƣơng (Balanophora laxiflora Hemsl.)
Định tính các nhóm chất chính trong dƣợc liệu theo phƣơng pháp hóa học ghi trong sách Thực tập Dƣợc liệu và Bài giảng Dƣợc liệu tập 1, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [7], [8].
2.3.2. Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc một số hợp chất từ phân đoạn n-hexan
- Chiết xuất: Chiết hồi lƣu nấm tỏa dƣơng với cồn 800. Sau đó gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm tới cắn thu đƣợc cao cồn nấm tỏa dƣơng.
- Chiết các phân đoạn: Hòa tan cao cồn nấm tỏa dƣơng vào 1 lƣợng tối thiểu nƣớc, siêu âm cho cao tan hoàn toàn, sau đó chiết lần lƣợt với các dung môi tăng dần độ phân cực: n-hexan, ethyl acetat. Sau đó, cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cặn tƣơng ứng: cặn n-hexan, cặn ethyl acetat và cặn nƣớc.
- Chọn phân đoạn để phân lập: Qua việc tìm hiểu các tài liệu nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy chƣa có một nghiên cứu nào trong nƣớc nghiên cứu về đối tƣợng nấm tỏa dƣơng (Balanophora laxiflora Hemsl.). Do đây là nghiên cứu đầu tiên trong nƣớc về đối tƣợng này và qua khảo sát sơ bộ các phân đoạn đã chiết bằng SKLM, chúng
tôi thấy phân đoạn n-hexan có nhiều tiềm năng nên trong đề tài này chúng tôi chọn phân đoạn n-hexan để phân lập các chất.
- Phân lập trên sắc ký cột:
+ Lựa chọn phân đoạn n-hexan để tiến hành sắc ký.
+ Chất hấp phụ: Silicagel 60 (cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm) đƣợc hoạt hóa ở 1100
C trong 1h, để nguội trong bình hút ẩm.
+ Cột sắc ký với các kích cỡ khác nhau phù hợp với từng khối lƣợng chất lên cột khác nhau.
+ Hệ dung môi rửa giải: sử dụng các hệ n-hexan : EtOAc, n-hexan : aceton, DCM : MeOH với các tỷ lệ khác nhau theo hƣớng tăng dần độ phân cực.
- Tinh chế chất thu đƣợc bằng phƣơng pháp kết tinh, rửa tủa với các dung môi thích hợp nhằm tinh chế chất đến mức tinh khiết nhất có thể.
- Độ tinh khiết của các chất phân lập đƣợc kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, tiếp theo đƣợc kiểm tra bằng HPLC, sau đó sử dụng các thông số vật lý (điểm chảy) và các phƣơng pháp phân tích khối phổ (phổ hồng ngoại IR, khối phổ ESI-MS, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H/13C-NMR), tham khảo cơ sở dữ liệu phổ của các tài liệu đã công bố để biện giải cấu trúc chất phân lập đƣợc.
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu thực vật
Mẫu nấm tỏa dƣơng tƣơi đƣợc TS. Nguyễn Thế Cƣờng và TS. Trần Huy Thái giám định mẫu có tên khoa học là Balanophora laxiflora Hemsl., với các tên khác là Nấm đất (Dó đất, Cu chó), thuộc họ Dó đất (Balanophoraceae), tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam (phụ lục 1).
3.2. Định tính các nhóm chất
- Mục đích: Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hóa học có trong nấm tỏa dƣơng.
- Tiến hành: Định tính các nhóm chất chính trong dƣợc liệu theo phƣơng pháp hóa học ghi trong sách Thực tập Dƣợc liệu và Bài giảng Dƣợc liệu tập 1, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [7], [8].
3.2.1. Định tính Alcaloid
Cân 0,5g bột dƣợc liệu khô vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15ml dung dịch H2SO4 1N. Đun đến sôi để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến PH 9-10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị vạn năng). Chiết alcaloid base bằng cloroform, loại nƣớc bằng natri sulfat khan. Dịch chiết đem lắc với H2SO4 1N hai lần mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết nƣớc đem chia đều vào ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống 2-3 giọt lần lƣợt các thuốc thử sau:
Ống 1: thuốc thử Mayer
Ống 2: thuốc thử Dragendorff
Kết quả: Dịch chiết trong các ống nghiệm trong suốt không tạo tủa. Phản ứng âm tính (-).
Kết luận: Dược liệu không có alcaloid.
3.2.2. Định tínhanthranoid
Phản ứng Borntrager: định tính anthranoid toàn phần:
Lấy 3g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích 100ml. Thêm 40ml dung dịch
H2SO41N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi khoảng 15 phút. Lọc dịch chiết
còn nóng qua giấy lọc hoặc qua 1 lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích
50ml. Làm nguội dịch lọc. Thêm 5ml n-hexan lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nƣớc. Giữ lớp n-
hexan làm phản ứng:
- Lấy 1ml dịch chiết n-hexan, thêm 1ml dung môi amoniac. Lắc nhẹ.
- Lấy 1ml dịch chiết n-hexan. Cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Hiện tƣợng: ống 1, ống 2 lớp nƣớc có màu vàng nhẹ, không thấy xuất hiện màu đỏ (-).
Kết Luận: Dược liệu không có anthranoid
3.2.3. Định tínhglycosid tim
Cho 5g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml cồn 25% rồi ngâm trong 24h. Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30% khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào cốc có mỏ dung tích 100 ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 2 lần với CHCl3: MeOH (4:1) mỗi lần 8ml. Gạn dịch chiết CHCl3 vào cốc có mỏ, loại nƣớc bằng Na2SO4. Chia
đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã đƣợc sấy khô và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu đƣợc đem tiến hành các phản ứng sau:
+ Phản ứng Liebermann-Burchardt:
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml anhydrid acetic,lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450..Cho từ từ theo thành ống 0,5ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Quan sát: Ở giữa hai lớp chất lỏng không thấy xuất hiện vòng màu đỏ tím.
+ Phản ứng legal:
Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5ml ethanol 900. Nhỏ1 giọt thuốc thử natri Nitroprussinat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều. Hiện tƣợng: không thấy xuất hiện màu đỏ cam (-).
+Phản ứng baljet:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (gồm một phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%). Hiện tƣợng không thấy xuất hiện màu đỏ cam.
Kết luận: Dược liệu không chứa glycosid tim.
Tiến hành chiết xuất dịch chiết cồn để định tính flavonoid và coumarin nhƣ sau:
Cân 20 g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 100ml. Thêm 50ml cồn 800, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng sau:
3.2.4. Định tính flavonoid
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại. Nhỏ từng giọt HCl đặc (3-5 giọt). Để yên một vài phút, dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ (+)
- Phản ứng với kiềm:
+ Phản ứng với NH3: Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết cồn lên mảnh giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng amoniac đặc đã đƣợc mở nút, sẽ thấy màu vàng của dịch chiết tăng lên (+).
+ Phản ứng với dung dịch NaOH: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết.Thêm vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện tủa màu vàng. Thêm 1ml nƣớc cất thấy tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng lên (+).
Hình 3.1. Phản ứng với NaOH
+ Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn. Thêm vào 2-3 giọt dd FeCl3 thấy xuất hiện tủa màu xanh đen (+).
Hình 3.2. Phản ứng với FeCl3 5%
Kết luận: Dược liệu có flavonoid.
3.2.5. Định tínhcoumarin
- Phản ứng đóng mở vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết cồn: Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2: để nguyên.
Đun cả 2 ống đến sôi để nguội quan sát thấy: Ống 1: xuất hiện tủa vàng.
Ống 2: trong.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nƣớc cất. Lắc đều rồi quan sát
thấy:
Ống 1: trong suốt. Ống 2: có tủa đục
Kết quả: Phản ứng dƣơng tính (+).
Hình 3.3. Phản ứng mở vòng lacton
Kết luận: Dược liệu có chứa coumarin.
Tiến hành chiết xuất dịch chiết nƣớc để làm các phản ứng định tính tanin, saponin, acid hữu cơ, acid amin, polysaccarid, đƣờng khử nhƣ sau:
Cân 20g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50 ml nƣớc cất, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng:
3.2.6. Định tínhsaponin
A: Quan sát hiện tƣơng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm to sạch 2 ml dịch chiết nƣớc,thêm 10ml nƣớc cất . Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc của ống nghiệm, để yên, quan sát thấy không có bọt bền vững sau 15 phút. Phản ứng âm tính (-)
Kết luận: Dược liệu không có saponin.
3.2.7. Định tính tanin
Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết nƣớc, làm các phản ứng sau: -Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm dịch chiết nấm tỏa dƣơng 2-3 giọt dd FeCl3 5% thấy xuất hiện kết tủa màu xanh đen (+).
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Thêm 2-3 giọt dung dịch gelatin 1%vào ống nghiệm chứa dịch chiết nấm tỏa dƣơng thấy xuất hiện tủa bông vàng (+).
- Phản ứng với chì acetat: Cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết nấm tỏa dƣơng 2-3 giọt dung dịch chì acetat 10% thấy xuất hiện tủa bông trắng (+).
- Phản ứng với đồng acetat: Cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết nấm tỏa dƣơng 2-3 giọt đồng acetat xuất hiện tủa nâu (+).
Ống chứng: Pƣ FeCl3 5%: Pƣ gelatin 1%: Pƣ Chì acetat: Pƣ Đồng acetat Hình 3.4. Các phản ứng định tính tanin
Kết luận: Dược liệu chứa tanin.
3.2.8. Định tínhacid hữu cơ
Cho vào ống nghiệm có dịch chiết nƣớc nấm tỏa dƣơng một ít tinh thể Na2CO3, quan sát thấy có bọt khí (+).
Hình 3.5. Định tính acid hữu cơ
Kết luận: Dược liệu có chứa acid hữu cơ.
3.2.9. Định tínhacid amin
Lấy 2ml dịch chiết nấm tỏa dƣơng vào ống nghiệm sạch, thêm vào 2-3 giọt thuốc thử ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút thấy chuyển sang màu tím (+).
Ống chứng: Ống Pƣ
Hình 3.6. Phản ứng với TT. Ninhydrin
Kết luận: Dược liệu có acid amin.
Lấy 2ml dịch chiết nấm tỏa dƣơng thêm vào 3 giọt thuốc thử Fehling A và Fehling B, đun cách thủy 10 không thấy có tủa đỏ gạch (-).
Kết luận: Dược liệu không có đường khử.
3.2.11. Định tính polysaccarid
Lấy 2 ống nghiệm sạch cho vào mỗi ống:
+: ống 1: 4ml nƣớc cất và 5 giọt thuốc thử lugol.
+: ống 2: 4ml dịch chiết nấm tỏa dƣơng và 5 giọt thuốc thử lugol không thấy xuất hiện màu nâu đỏ.(-)
Kết luận: Dược liệu không có polysaccarid.
Tiến hành chiết xuất dịch chiết ether dầu hỏa để làm các phản ứng định tính sterol, chất béo, caroten nhƣ sau:
3.2.12. Định tính chất béo
Nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi thấy để lại vết mở trên giấy lọc (+).
Hình 3.7. Vết mờ để lại trên giấy lọc sau sấy
Kết luận: Dược liệu có chất béo.
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi hết dung môi đến khô. Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kĩ. Để nghiêng 45° nhỏ từ từ dung dịch H2SO4 theo thành ống nghiệm thấy xuất hiện mặt phân cách màu đỏ tím.(+)
Hình 3.8. Xuất hiện mặt phân cách màu đỏ tím sau khi cho H2SO4 đặc
Kết luận: Dược liệu có chứa sterol
3.2.14. Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi cách thủy đến cắn, thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn, không thấy xuất hiện màu xanh (-)
Kết luận: Dược liệu không có caroten.
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong nấm tỏa dƣơng đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính nhóm chất hữu cơ trong nấm tỏa dƣơng TT Nhóm chất Phản ứng định tính Nấm tỏa
dƣơng
1 TT. Dragendorff -
TT. Bouchardat -
2 Anthranoid Pƣ Borntrager -
3
Glycosid tim Pƣ Liebermann -
Pƣ Baljet -
Pƣ Legal -
4
Flavonoid Pƣ với Cyanidin +++
Pƣ với hơi NH3 +++
Pƣ với NaOH 10% +++
Pƣ với FeCl3 5% +++
5 Coumarin Pƣ mở đóng vòng lacton +++
6 Saponin Hiện tƣợng tạo bọt -
7
Tanin Pƣ với FeCl3 5% +++
Pƣ với gelatin 1% +++
Pƣ với chì acetat 10% +++
8 Acid hữu cơ Pƣ với Na2CO3 +
9 Acid amin Pƣ với TT Ninhydrin +++
10 Đƣờng khử Pƣ với TT. Fehling -
12 Sterol Pƣ với H2SO4/anhydrid acetic
+
13 Caroten Pƣ với H2SO4 -
Ghi chú: (-) âm tính, (+) dƣơng tính, (+++) dƣơng tính rõ.
3.3. Phân lập một số hợp chất trong nấm tỏa dƣơng 3.3.1. Chiết các phân đoạn từ nấm tỏa dƣơng 3.3.1. Chiết các phân đoạn từ nấm tỏa dƣơng
- Chiết cao cồn: 3kg dƣợc liệu chia làm 3 mẻ, mỗi mẻ chiết nóng 3 lần với 8 lít EtOH 80% cho mỗi lần chiết. Gộp dịch chiết của các lần, cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm sau đó cô cách thủy đến cắn thu đƣợc 895,8 gam cao cồn nấm tỏa dƣơng.
- Chiết phân đoạn: Hòa tan cao cồn trong 1 lít nƣớc, khuấy kĩ sau đó siêu âm cho hòa tan hoàn toàn rồi chiết lần lƣợt với các dung môi: n-hexan, EtOAc theo tỉ lệ1:1 (chiết mỗi phân đoạn 3 lần), thu dịch chiết các phân đoạn, cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm các phân đoạn đó tới cắn tƣơng ứng, cắn n-hexan (59,6 g), cắn ethyl acetat (124,1 g), cắn nƣớc (603,4 g). Sơ đồ chiết xuất nấm tỏa dƣơng đƣợc trình bày theo hình 3.9.
Dƣợc liệu đã đƣợc làm nhỏ (3kg) Chiết nóng bằng cồn 800 3 lần x 8L, mỗi lần 3h Cao cồn 800 (859,8 g )
Lƣu làm đối chiếu (89,6 g ) Lắc các phân đoạn (806,2 g )
Cao n-hexan (59,6 g )
Cao EtOAc( 124,1 g)
Cao nƣớc (603,4 g ) Dịch chiết cồn
Cất thu hồi dung môi
Dịch chiết n-Hexan
Dịch chiết EtOAc
Dịch chiết nƣớc Cất thu hồi dung môi
Cất thu hồi dung môi
Cô cách thủy Lắc với n-hexan
Hình 3.9. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn nấm tỏa dƣơng.
3.3.2. Định tính các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng
Mục đích: Khảo sát các phân đoạn nấm tỏa dƣơng bằng SKLM để lựa chọn phân đoạn có nhiều vết đệm với các giá trị Rf khác nhau để thuận lợi cho quá trình phân lập các chất bằng sắc ký cột.
Tiến hành: Hòa tan lƣợng nhỏ cặn n-hexan nấm tỏa dƣơng trong 1ml CHCl3.
Hòa tan lƣợng nhỏ cao cồn, cặn ethyl acetat, cặn nƣớc trong 1 ml MeOH. Sau đó
chấm sắc ký lớp mỏng với bản mỏng tráng sẵn silica gel GF254 (Merck) đã hoạt hóa
với hệ dung môi n-hexan: EtOAc (20:1).
Hình 3.10. Sắc ký đồ 4 phân đoạn (Cao cồn: Cắn n-hexan: Cắn EtOAc: Cắn nƣớc) Theo các tài liệu tra cứu đƣợc, hiện nay ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học của nấm tỏa dƣơng ở phân đoạn n-hexan cũng nhƣ các phân đoạn khác. Mặt khác, trên sắc kí lớp mỏng phân đoạn n-hexan có nhiều vết đậm với các giá trị Rf khác nhau vì vậy trong nghiên cứu này phân đoạn n-hexan đƣợc chọn làm đối tƣợng để nghiên cứu phân lập các hợp chất của nấm tỏa dƣơng.
3.3.3. Phân lập các chất ở phân đoạn n-hexan
3.3.3.1 Định tính phân đoạn n-hexan bằng sắc ký lớp mỏng
- Mục đích: Khảo sát sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn hệ dung môi rửa giải tốt nhất nhằm phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột.
- Tiến hành: Hòa tan lƣợng nhỏ cắn của phân đoạn n-hexan trong CHCl3. Chấm sắc
