Định tính các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng

Một phần của tài liệu Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của nấm tỏa dương ( balanophora laxiflora hemsl ) (Trang 40)

Mục đích: Khảo sát các phân đoạn nấm tỏa dƣơng bằng SKLM để lựa chọn phân đoạn có nhiều vết đệm với các giá trị Rf khác nhau để thuận lợi cho quá trình phân lập các chất bằng sắc ký cột.

Tiến hành: Hòa tan lƣợng nhỏ cặn n-hexan nấm tỏa dƣơng trong 1ml CHCl3. Hòa tan lƣợng nhỏ cao cồn, cặn ethyl acetat, cặn nƣớc trong 1 ml MeOH. Sau đó chấm sắc ký lớp mỏng với bản mỏng tráng sẵn silica gel GF254 (Merck) đã hoạt hóa với hệ dung môi n-hexan: EtOAc (20:1).

Hình 3.10. Sắc ký đồ 4 phân đoạn (Cao cồn: Cắn n-hexan: Cắn EtOAc: Cắn nƣớc) Theo các tài liệu tra cứu đƣợc, hiện nay ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học của nấm tỏa dƣơng ở phân đoạn n-hexan cũng nhƣ các phân đoạn khác. Mặt khác, trên sắc kí lớp mỏng phân đoạn n-hexan có nhiều vết đậm với các giá trị Rf khác nhau vì vậy trong nghiên cứu này phân đoạn n-hexan đƣợc chọn làm đối tƣợng để nghiên cứu phân lập các hợp chất của nấm tỏa dƣơng.

3.3.3. Phân lập các chất ở phân đoạn n-hexan

3.3.3.1 Định tính phân đoạn n-hexan bằng sắc ký lớp mỏng

- Mục đích: Khảo sát sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn hệ dung môi rửa giải tốt nhất nhằm phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột.

- Tiến hành: Hòa tan lƣợng nhỏ cắn của phân đoạn n-hexan trong CHCl3. Chấm sắc ký lớp mỏng bản Silica gel GF254 (Merck) đã hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ.

Khảo sát với các loại hệ dung môi sau: H1: n-hexan: EtOAc (15: 1) H2: n-hexan: aceton (10: 1) H3: CHCl3: MeOH (50: 1)

- Kết quả: hệ H1 tách các chất tốt nhất, các vết tách nhau rõ ràng,Rf khác nhau. Vì vậy, chúng tôi chọn hệ H1 để phân lập phân đoạn n-hexan.

Hình 3.11. Sắc ký đồ phân đoạn n-hexan nấm tỏa dƣơng với hệ H1. UV 254 nm UV 365nm TT H2SO4 10%, t0

3.3.3.2 .Phân lập các chất bằng sắc ký cột

- Mục đích: Dùng sắc ký cột để phân lập các chất trong phân đoạn, dựa trên sự hấp phụ các chất vào silica gel và rửa giải bằng hệ dung môi có độ phân cực thích hợp. - Chuẩn bị mẫu: Hòa tan hoàn toàn 58 g (để lại khoảng 1,6g cắn làm chất đối lƣu) cắn n-hexan với lƣợng tối thiểu CHCl3 trong bình cầu, thêm 58g silica gel lắc đều cho hấp phụ. Cô quay chân không ở nhiệt độ thấp đến khô hoàn toàn. Lấy silica gel đã hấp phụ ra cối sứ, dùng chày nghiền để thu đƣợc hỗn hợp chất rắn có thể chất tơi xốp, đồng đều, không vón cục.

- Chuẩn bị cột sắc ký :

+ Cân khoảng 600g silica gel ( cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm) cho vào bình nón to, thêm

n-hexan vào sao cho sau khi silica gel hút đủ lƣợng dung môi cần thiết để trƣơng nở, khuấy kĩ cho thoát hết bọt khí. Để yên 1h cho silica gel trƣơng nở hoàn toàn. + Chuẩn bị cột: Dùng cột có kích thƣớc lớn (cột thô) với chiều dài 50cm, đƣờng kính cột 6,5cm, rửa sạch sau đó sấy khô.

+ Lên cột: Dùng 1 lƣợng nhỏ bông thủy tinh trung tính đặt ở dƣới đáy cột (để giữ silica gel trên cột), thêm 1 ít dung môi n-hexan để đuổi hết bọt khí ở bông thủy tinh sau đó đƣa silica gel đã chuẩn bị lên cột, dùng quả bóp cao su gõ cột cho silica gel đƣợc nén đều đồng thời mở khóa để dung môi chảy qua cột. Sau đó để cột chạy với dung môi n-hexan để cột ổn định. Sau khi cột đã ổn định đƣa hỗn hợp silica gel đã hấp phụ chất lên cột. Cho 1 lớp bông thủy tinh trung tính mỏng lên phía bên trên, tránh lớp silica gel phía trên bị xáo động trong quá trình rửa giải.

- Giải hấp phụ bằng hệ dung môi n- hexan: EtOAc với tỉ lệ n-hexan giảm dần từ 200% đến 1% . Mở khóa chỉnh tốc độ dòng chảy khoảng 30 giọt/phút. Hứng các phân đoạn này bằng ống nghiệm 50ml, kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM, gộp các phần có sắc ký đồ tƣơng tự nhau thu đƣợc 7 phân đoạn kí hiệu từ I1 I7

Hình 3.12. Sơ đồ phân lập 3 chất trong phân đoạn n-hexan.

a. Phân lập hợp chất BL1

Phân đoạn I3 (4,51g) phân lập sắc ký pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải n- hexan: aceton với tỉ lệ lần lƣợt là 35: 1-10: 1 thu đƣợc 4 phân đoạn. Phân đoạn I3.2 xuất hiện tinh thể hình kim. Tiến hành rửa tủa bằng dung môi aceton thu đƣợc 508,6 mg chất kết tinh màu trắng kí hiệu là BL1. Xác định cấu trúc chất thu đƣợc bằng các phƣơng pháp vật lý hiện đại gồm đo phổ IR, phổ NMR, phổ MS.

b. Phân lập hợp chất BL2

Phân đoạn I4 (1,72g) phân lập sắc ký pha thƣờng với hệ dung môi n-hexan: aceton (15: 1) thu đƣợc 3 phân. Phân đoạn I4.2 xuất hiện chất kết tinh màu trắng. Tiến hành rửa tủa với dung môi aceton thu đƣợc 235,4 mg chất bột màu trắng kí

Silica gel CC. HE 25:1-1:2 I1 (25,96 g) I2 (5,76 g) I3 (4,51 g) I4 (1,72 g) I5 (1,79 g) I6 (1,25 g) I7 (1,05 g) BL1 508,6 mg BL2 235,4 mg BL3 115,1 mg Cao hexan (59,6 g ) Silica gel CC HA(35: 1- 10: 1) Silica gel CC HA(15:1) Silica gel CC DM, DAW

hiệu là BL2. Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết bằng SKLM thấy không bắt UV ở bƣớc sóng 254 và 365nm, sau khi phun thuốc thử hiện màu là H2SO4 10% trong cồn hơ nóng trên bếp điện thấy có 1 vết đậm, đồng nhất trên bản mỏng.

c. Phân lập hợp chất BL3

Phân đoạn I7 (1,05g) phân lập sắc ký pha thƣờng với hệ dung môi DCM: MeOH (50: 1-25: 1) thu đƣợc 4 phân đoạn. Phân đoạn I7.2 tiếp tục phân lập sắc kí cột pha thƣờng với hệ dung môi n-hexan: aceton thu đƣợc phân đoạn I7.2.1 Phân đoạn I7.2.1 phân lập sắc kí cột pha thƣờng với hệ dung môi DCM: aceton : H2O (35: 1: 0,1) thu đƣợc 115,1mg chất màu trắng kí hiệu là BL3.

Lấy 1 lƣợng nhỏ BL1, BL2, BL3 hòa trong 1 ml CHCl3 . Chấm sắc ký lớp mỏng bản Silica gel GF254 (Merck) với hệ dung môi HA (2: 1). Chất BL1, BL2 không bắt màu huỳnh quang ở UV 254nm và UV 366nm. Chất BL3 bắt màu huỳnh quang ở UV 254nm. Chất BL2, BL3 hiện màu hồng đậm trên SKLM sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng. Chất BL1 hiện màu vàng sau chuyển sang màu hồng đậm trên SKLM sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng. Sơ đồ phân lập 3 chất thể hiện qua hình 3.12.

Hình 3.13. Sắc ký đồ chấm so sánh BL1,BL2, với cắn n-hexan.

Hình 3.14. Sắc ký đồ so sánh BL3 với phân đoạn n-hexan

3.3.4. Biện giải cấu trúc chất phân lập đƣợc3.3.4.1. Chất BL1 3.3.4.1. Chất BL1

- Tính chất của BL1: Là chất có dạng tinh thể màu trắng, có nhiệt độ nóng chảy là 2100C - 2130C, không hiện UV trên SKLM, hiện màu hồng tím sau khi phun dung dịch H2SO4 10% trong cồn và hơ nóng trên bếp điện.

- BL1 sau khi đã tinh chế đƣợc đem đo các phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR), khối phổ (ESI-MS) để xác định cấu trúc.

- Phổ IR (Xem phụ lục 2) cho thấy hợp chất BL1 có hấp thụ của nhóm OH ở vùng 3314,48 cm-1, CH ở vùng 2954,06 cm-1, ở vùng 1640,27 và 1461,91 cm-1 đắc trƣng cho liên kết C=C. Phổ 1

H-NMR và 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT đã xác định đƣợc hợp chất BL1 có 30 carbon. Phổ khối ghi theo chế độ ESI (+) (xem phụ lục 3) cho pic phân tử [M]+ = 427,0. Từ các dữ liệu phổ 13C và ESI- MS cho phép xác định công thức phân tử chất này là C28H58O, (giá trị phổ khối

theo tính toán 426,8). Đây là một triterpen có 5 vòng cùng với một liên kết đôi trong phân tử.

+Trên phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của chất BL1 xuất hiện tín hiệu đặc trƣng cho hydroxy methin C-3 (δH 3,21, 1H, m). 7 tín hiệu singlet đặc trƣng cho 7 nhóm methyl (δH 0,76; 0,78; 0,87; 0,94; 0,96; 1,03; 1,56), thêm vào đó sự có mặt của nhóm methin olefinic thể hiện qua tín hiệu ở δH 4,68 ppm (1H, d, J = 1,8 Hz, H-29a) và δH 4,56 ppm (1H, q, J = 1,8 Hz, H-29a). cho ta các giả thuyết về một phần cấu trúc đặc trƣng cho triterpen khung lupan.

+ Trên phổ 13C-NMR có các tín hiêu đặc trƣng δC = 151,0 ppm đặc trƣng cho C-20, δC = 109,3 ppm đặc trƣng cho C-29, δC = 79,0 ppm đặc trƣng cho nhóm C-3. Phân tích phổ C13 và phổ DEPT cho thấy hợp chất BL1 có 30 carbon, trong đó có 6 nhóm CH, 11 nhóm CH2, 7 nhóm CH3, 6 carbon bậc 4. Dựa trên những kết quả thu đƣợc từ những dữ liệu phổ 1H và 13C – NMR, phổ khối, phổ IR của hợp chất phân lập đƣợc kết hợp so sánh với tài liệu đã công bố về hợp chất lupeol có cơ sở để khẳng định chất BL1 đƣợc xác định là 3α-hydroxy-lup- 20(29)-en hay lupeol [3], [18].

H HO H H 29 30 20 19 21 28 17 16 15 27 14 13 12 11 9 18 8 26 7 6 5 4 23 24 3 2 1 10 25 22

Hình 3.15. Công thức cấu tạo của lupeol

Vị trí Phổ NMR của BL1 ( CDCl3) Phổ NMR của lupeol [3], [18] δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) C-1 38,1 38,7 C-2 25,2 1,61 ( 3H, s) 27,5 C-3 79,4 3,2 (1H, m) 79,0 3,18 (1H, dd, J = 4,8 and 11, 6 Hz) C-4 38,7 38,9 C-5 55,3 0,68 (1H, d) 55,3 0,68 (d, 1H, J = 9,5 Hz) C-6 18,3 1,38 ( 1H, q) 18,3 C-7 34,3 34,3 C-8 40,9 40,9 C-9 50,5 1,21 (1H, s) 50,4 C-10 37,2 37,2 C-11 20,9 1,52 (1H, d) 21,0 C-12 27,5 1,25 (1H, d) 25,2 C-13 38,9 1,65 (1H, t) 38,1 C-14 42,9 1,42 ( 1H, d) 42,9 C-15 28,0 1,08 (1H, d) 27,5 C-16 35,6 35,6 C-17 43,0 43,0 C-18 48,3 48,0 C-19 48,0 2,38 (1H, m) 48,3 2,35 (1H, dt, J = 11; 5,5 Hz) C-20 151,0 150,9 C-21 29,9 1,93 (1H, m) 1,33 ( 1H, s) 29,7 1,87–1,96 (m)

C-22 40,0 40,0 C-23 29,1 1,15 ( 1H, s) 1,03 (3H, s) 28,0 0,97 (3H, s) C-24 15,4 15,4 0,76 (s, 3H) C-25 16,1 0,94 (3H, s) 16,0 0,83 (3H, s) C-26 16,0 16,1 1,03 (3H,s) C-27 14,6 0,96 (3H, s) 14,6 0,95 (3H, s) C-28 18,0 0,83 ( 3H, s) 18,0 0,79 (3H, s) C-29 109,3 4,68 (1H, d, J = 1,8 Hz) 4,57 (1H, q, J = 1,8Hz) 109,3 4,57 (1H, br s) 4,69 (1H, br s) C-30 19,3 1,68 (3H, s) 19,3 1,66 (3H, s) 3.3.4.2. Chất BL2

- Tính chất: Tinh thể hình kim không màu, điểm nóng chảy 1680C - 1690C, tan trong chloroform, không tan trong methanol, không hấp thụ ánh sáng UV. Trên sắc ký bản mỏng, sau khi phun dung dịch H2SO4 10% trong cồn và hơ nóng trên bếp điện thấy hợp chất này có màu hồng tƣơi rồi xanh tím dần dần.

- Sau khi chấm so sánh β-sitosterol chuẩn lƣu tại khoa Hóa thực vật- Viện Dƣợc liệu. Kết quả ghi nhận trên sắc ký đồ cho thấy thời gian lƣu của hợp chất BL2 và hợp chất β-sitosterol giống nhau (Rf =0,54) trên sắc ký đồ của SKLM với hệ dung môi n-hexan: aceton (2:1) nên kết luận BL2 là hợp chất β-sitosterol. Do đó chúng tôi không tiến hành đo và giải phổ hợp chất BL2.

Hình 3.16. Sắc kí đồ của BL2 và β-sitosterol trên SKLM

3.3.4.3. Chất BL3

- Tính chất: Là chất bột màu trắng, tan trong cloroform, aceton, hấp thụ ánh sáng UV ở bƣớc sóng 254nm trên SKLM, hiện màu hồng tím sau đó chuyển sang màu tím sau khi phun TT H2SO4 10% trong cồn và hơ nóng trên bếp điện.

- Do thời gian có hạn nên chúng tôi chƣa xác định đƣợc cấu trúc hợp chất BL3.

BÀN LUẬN

Về mục đích chọn đề tài

Nấm tỏa dƣơng là một dƣợc liệu quý có tác dụng sinh học rất tốt nhƣng trong nƣớc chƣa có một nghiên cứu nào về dƣợc liệu này đặc biệt là các nghiên cứu về thành phần hóa học. Do vậy nhóm tác giả đề xuất tên của đề tài này là:“

Bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Tỏa dƣơng (Balanophora laxiflora Hemsl.)”. Những kết quả thu nhận đƣợc trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này chỉ là những nghiên cứu ban đầu về thành phần hóa học của nấm tỏa dƣơng, tạo nền móng cho các nghiên cứu sâu hơn về loại dƣợc liệu này.

Về đặc điểm thực vật của nấm tỏa dƣơng

Nấm tỏa dƣơng có các đặc điểm thực vật học rất đặc trƣng nhƣng vẫn có khả năng nhầm lẫn với 1 số cây khác nhƣ Dó đất hình cầu, Dó đất cúc phƣơng, Sơn Dƣơng, Dó đất. Năm loại dƣợc liệu này đều có ở Việt Nam. Mô tả đặc điểm thực vật của nấm tỏa dƣơng nhằm phân biệt rõ ràng tránh nhầm lẫn với các loại dƣợc liệu vừa kể trên.

Một số đặc điểm đặc trƣng của nấm tỏa dƣơng nhằm phân biệt với 4 loài cùng chi với nấm tỏa dƣơng có mặt ở Việt Nam là [2]:

- Củ hình trứng, bề mặt có mụn hình sao nổi rõ.

- Thân khí sinh mang 5-10 lá dạng vẩy ở phần gốc, phiến lá hình mác, cỡ 2-2,5 x 1-1,5 cm.

- Hoa đơn tính khác gốc, họp thành bông nạc. Cụm hoa đực hình trụ, gồm những hoa gần nhƣ không cuống; bao hoa gồm 6 mảnh, trong đó có 2 mảnh giữa (đối diện nhau) lớn hơn và cụt đầu, các mảnh bên hình trái xoăn tròn đầu; khối phấn bị ép ngang (hình ảnh 2.1)

Về việc giám định tên loài thực vật

Giám định mẫu nấm tỏa dƣơng đƣợc thực hiện ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Việc giám định tên nhằm khẳng định chắc chắn rằng đối tƣợng mà chúng tôi nghiên cứu là nấm tỏa dƣơng (Balanophora laxiflora Hemsl.).

Về thành phần hóa học

Chúng tôi đã xác định đƣợc trong nấm tỏa dƣơng có sự có mặt của các nhóm chất gồm: flavonoid, coumarin, tannin, acid hữu cơ, acid amin, chất béo, sterol. Từ kết quả định tính này cho thấy đƣợc phân đoạn n-hexan mà chúng tôi

chọn tách sẽ có sự có mặt tập trung của nhóm chất béo, sterol và các triterpen mà chúng tôi đã tách đƣợc.

Về chiết xuất

Lựa chọn phƣơng pháp chiết nóng với dung môi EtOH 800, đây là dung môi có khả năng chiết đƣợc hầu hết các hoạt chất trong thực vật, rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hại, sôi ở nhiệt độ cao nên phù hợp với pháp chiết nóng. Chiết nóng ở 800

C có ƣu điểm là làm tăng tốc độ khuếch tán trong quá trình chiết xuất, nên làm tăng lƣợng chất khuếch tán; do đó, có thể chiết kiệt hoạt chất và tiết kiệm đƣợc thời gian.

Về phân lập chất

Qua quá trình khảo sát sơ bộ trên SKLM ở phân đoạn n-hexan nhận thấy phân đoạn này có nhiều vết đậm, có các giá trị Rf thích hợp để phân lập các hợp chất.

Phân đoạn n-hexan phân lập đƣợc ba hợp chất gồm lupeol, β-sitosterol, và BL3 bằng cách sử dụng các phƣơng pháp SKLM, sắc ký cột pha thƣờng. Cấu trúc của hợp chất BL1 đƣợc xác định dựa trên dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân, phổ IR, phổ khối lƣợng phân tử có so sánh với dữ liệu phổ đã đƣợc công bố về hợp chất lupeol. Hợp chất BL2 có giá trị Rf tƣơng ứng với hợp chất β-sitosterol khi chấm đối chiếu trên SKLM, do vậy chúng tôi không tiến hành đo phổ mà kết luận hợp chất BL2 là β-sitosterol. Hợp chất BL3 đang đo phổ và hiện tại chƣa có dữ liệu phổ để xác định cấu trúc.

Lupeol có đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn, chống lại các động vật đơn bào- nguyên sinh, chống ung thƣ, ngăn ngừa ung thƣ, đặc biệt là ung thƣ da và tuyến tiền liệt đang cho kết quả thử nghiệm khả quan [11], [17].

β-Sitosterol là một hợp chất rất phổ biến trong thiên nhiên tìm thấy trong nhiều loài thực vật nhƣ Nigella sativa, Serenoa repens, Cucurbita pepo, Pygeum

africanum…[6]. β- sitosterol làm giảm cholesterol máu, tăng sản tuyến tiền liệt lành tính [9].

Chất BL3 hợp chất này do thời gian có hạn nên chúng tôi chƣa có điều kiện đo phổ và giải phổ. Chất này sẽ đƣợc nghiên cứu trong những đề tài tiếp theo.

Đây là nghiên cứu đầu tiên về nấm tỏa dƣơng ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu tạo điều kiện cho các đề tài nghiên cứu sau này.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận

Sau quá trình thực hiện khóa luận, chúng tôi đã thu đƣợc một số kết quả sau:

Một phần của tài liệu Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của nấm tỏa dương ( balanophora laxiflora hemsl ) (Trang 40)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(67 trang)