Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được theo phương pháp SRB [17].
Nguyên tắc:
Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sĩt của tế bào. Tế bào ung thư được nuơi cấy trong đĩa 96 giếng.
Hợp chất Sulphorhodamin B (SRB) biến đổi thành aminoxanthin cĩ màu hồng, được các acid amin cần thiết trong tế bào sống hấp thu. Càng nhiều tế bào sống, sự hấp thu càng nhiều. Các tế bào sống, sau đĩ được cố định. Định lượng các chất màu được tế bào hấp thu bằng máy quang phổ kế ở bước sĩng 495-515 nm. Từ đĩ tính được số lượng tế bào sống sĩt. Phương pháp này hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (National Cancer Institution - NCI).
Dịng tế bào thử nghiệm:
3 dịng tế bào:
-Dịng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan).
-Dịng tế bào PC3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt).
Chất chuẩn dƣơng tính
Sử dụng chất chuẩn cĩ khả năng diệt tế bào: Ellipticin của hãng Sigma.
Tiến hành thử hoạt tính
a/ Chuẩn bị tế bào
-Tế bào ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn. Sau khi tế bào được hoạt hĩa phát triển đến phase log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến vi lượng 96 giếng đối với phương pháp SRB.
-Mẫu thử nghiệm bao gồm: tế bào + mơi trường nuơi cấy + mẫu thử được ủ trong tủ ấm CO2/370C để tế bào tiếp tục phát triển.
-Ủ đĩa nuơi cấy từ 48 giờ-72 giờ (37o
C, 5% CO2)cho phép chất thử phát huy tác dụng.
b/ Quy trình thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp SRB [28]
-Tế bào sau khi được ủ từ 48-72 giờ được cố định bằng TCA ở 40C trong 1 giờ, sau đĩ rửa sạch bằng nước và để khơ tự nhiên.
-Thêm 50 μl dung dịch sulphorhodanin B (SRB) vào mỗi giếng của đĩa nuơi cấy, nhuộm ở nhiệt độ phịng trong 30 phút.
-Rửa sạch dung dịch sulphorhodanin B (SRB) dư bằng dung dịch acid acetic 1% 5 lần.
-Hồn trả sulphorhodanin B đã được nhuộm vào tế bào. Lắc kỹ để hịa tan hồn tồn.
-Đọc mật độ quang ở bước sĩng 492-515 nm. Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sĩt.