Mục đích: Chứng minh sự có mặt của các chất khác hay dung môi pha động không ảnh hưởng đến việc định lượng auraiiiamid acetat và ergosterol peroxid.
Tiến hành sắc ký các mẫu và thu được các sắc ký đồ tương ứng như sau: - Mầu trắng: Pha động (Hình 3.7).
- Mầu chất nghiên cứu aurantiamid acetat hòa tan trong methanol (Hình 3.3). - Mầu chất nghiên cứu ergosterol peroxid hòa tan trong methanol (íỉình 3.4). - Mau hỗn hợp của aurantiamid acetat và ergosterol peroxid hòa tan trong methanol (Hình 3.1).
- Mẩu thử chuẩn bị từ hoa Gạo (Hình 3.2).
Hình 3.7. Sắc ký đồ của mầu trắng (pha động). Nhận xét:
- Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không thấy xuất hiện pic tại các thời điểm khoảng 5,3 phút và 8,2 phút (hình 3.7).
- Trên sắc ký đồ của mẫu thử (hình 3.2), mẫu riêng aurantiamid acetat (hình 3.3) và mẫu hỗn hợp 2 hợp chất nghiên cứu (hình 3.1) đều thấy xuất hiện pic tại thời gian lưu khoảng 5,3 phút. Các sắc ký đồ của mẫu không chứa aurantiamid acetat đều không xuất hiện pic này (Hình 3.4 và 3.7).
- Tương ạr, trên sắc ký đồ mẫu thử (hình 3.2), mẫu riêng ergosterol peroxid (hình 3.4) và mẫu hỗn họp 2 hợp chất nghiên cứu (hình 3.1) đều thấy xuất hiện pic
tại thời gian lưu khoảng 8,2 phút. Các sắc ký đồ của mẫu không chứa ergosterol peroxid đều không xuất hiện pic này (Hình 3.3 và 3.7).
- Pic của aurantiamid acetat và ergosterol peroxid trên các sắc ký đồ cân đối, rõ nét, tách riêng biệt, pic các chất tách nhau hoàn toàn.
Vậy phương pháp có tính đặc hiệu với aurantiamid acetat và ergosterol peroxid.
3.5.3. Khảo sát độ lặp lại
Tiêm lặp lại 6 lần với một dung dịch ở nồng độ khảo sát đối với mỗi chất nghiên cứu vào hệ thống sắc ký để khảo sát độ lặp lại, kết quả thu được như ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ket quả khảo sát độ lặp lại
Hợp chất Diện tích pic (mAU.s)
Aurantiamid acetat Ergosterol peroxid
1 84511 29180 2 84491 29195 3 84603 29190 4 84358 29230 5 84371 29120 6 84605 29190 Trung bĩnh 84489,8 29184,2 RSD (%) 0,13 0,12
Nhận xét: Với điều kiện sắc ký đã chọn, phương pháp có độ lặp lại tốt (RSD khoảng 0,12 - 0,13%), có thể áp dụng để xác định hàm lượng các chất phân lập từ hoa Gạo.
3.5.4. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
- Tiến hành: Pha một dãy dung dịch aurantiamid acetat có nồng độ biến thiên trong khoảng từ 4,6 55,1 |0,g/mL và ergosterol peroxid có nồng độ biến thiên trong khoảng từ 4,5 ^ 53,8 |ig/mL.
- Thiết lập phương trình hồi quy biếu hiện sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất nghiên cứu có dạng y= ax + b; tính hệ số tương quan r.
- Kết quả được trình bày trong bảng 3.4 và bảng 3.5, hình 3.8 và hình 3.9.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ tuyển tính của aurantiamid acetat.
STT 1 2 3 4 5 6
Nông độ c (ụ,g/mL) 4,6 9,2 18,4 27,5 36,7 55,1
Diện tích pic (mAU.s) 21107 42255 84511 126788 169022 260654
Nồng độ c (mcg/mL)
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của aurantỉamid acetat.
Phương trình hồi quy tuyến tính: s = 4725,54.c - 1930,35 với hệ số tương quan r = 0,9998.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính cỉia ergosterol peroxid.
STT 1 2 3 4 5 6
Nồng độ c (|J.g/mL) 4,5 9,0 17,9 26,9 35,8 53,8
N'ông độ c (mcg/mL)
Hình 3.9. Đô thị biêu diên sự phụ thuộc tuyên tính giữa diện tích pic và nồng độ của ergosterol peroxid.
Phương trình hồi quy tuyến tính: s = 1647,54.c - 333,24 với hệ số tương quan r= 0,9999.
Nhận xét: Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích và nồng độ chất nghiên cứu với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (với aurantiamid acetat có r = 0,9998 và ergosterol peroxid có r = 0,9999). Kết quả này được sử dụng làm cơ sở để lựa chọn nồng độ định lượng của các hợp chất nghiên cứu tương ứng.
3.5.5. Giói hạn phát hiện và giói hạn định lượng
- Tiến hành pha loãng dần dung dịch chuẩn của aurantiamid acetat và ergosterol peroxid vói nồng độ ban đầu lần lượt là 4,5 |ag/mL và 4,6 |jg/mL đến nồng độ thấp nhất sao cho vẫn nằm trong khoảng tuyến tính, sau đó tiến hành sắc ký. Tỉ lệ S/N được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng của mẫu trắng, từ đó tính được nồng độ tối thiểu của 2 chất có thể phát hiện được.
- Nồng độ tối thiểu của aurantiamid acetat và ergosterol peroxid tại đó chiều cao pic gấp 3 lần nhiễu đường nền (S/N) được xác định theo thứ tự là 0,50 |ag/mL và 0,61 Ịig/mL. Vậy, giới hạn phát hiện của aurantiamid acetat và ergosterol peroxid lần lượt là 0,50 Ịj,g/mL và 0,61 |ig/mL.
- Nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó chiều cao pic của hai chất nghiên cứu gấp 10 lần độ nhiễu đường nền (S/N) và có độ chính xác chấp nhận đo được là:
aurantiamid acetat là 1,25 |ag/mL và ergosterol peroxid là 1,43 ịig/mL. Vậy giới hạn định lượng của aurantiamid acetat và ergosterol peroxid lần lượt là 1,25 fig/mL và
1,43 Ị.ig/mL.
3.5.6. Khảo sát độ đúng
Với 6 mẫu, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn đã ghi ở mục 3.2 và tính lượng hoạt chất thu hồi được. Độ đúng của phương pháp được đánh giá bằng cách so sánh lượng chất chuẩn tìm lại được so với lượng chất chuẩn thêm vào ban đầu. Kết quả được tổng hợp chi tiết cho từng chất được thể hiện ở bảng 3.6 và bảng 3.7.
Bảng 3.6. Ket quả khảo sát độ đúng với aurantiamid acetat
TT c thêm (Mg/mL) c cũ (Hg/mL) c mới (|ag/mL) % tìm lại 1 7,34 40,22 47,49 98,99 2 7,34 40,27 47,48 98,13 3 7,34 39,85 47,08 98,41 4 7,34 40,05 47,5 101.49 5 7,34 40,03 47,46 101,19 6 7,34 40,1 47,45 100,19 Trung bình 99,73 RSD (%) 1,44 --- ?--- ---
Bảng 3.7. Kêt quả khảo sát độ đúng với ergosterol peroxid.
TT c thêm (|ig/mL) c cũ (lag/mL) c mới (|jg/mL) % tìm lại 1 7,17 45,97 53,44 104.25 2 7,17 46,46 53,43 97,30 3 7,17 46,27 53,49 100,75 4 7,17 46,34 53,5 99,89 5 7,17 46,49 53,5 97,71 6 7,17 46,29 53,49 100,53 Trung bình 100,07 RSD (%) 2,51
Nhận xét. Kết quả khảo sát cho thấy, phương pháp có độ đúng cao (tỷ lệ tìm lại trung bình đạt 99,73% đối với aurantiamid acetat và 100,07% đối với ergosterol peroxid), phương pháp phân tích có tỉ lệ thu hồi cao. Hệ thống sắc ký trên phù hợp cho việc phân tích định tính, định lưọng đồng thời aurantiamid acetat và ergosterol peroxid trong hoa Gạo bằng phương pháp HPLC.
3.6. ỨNG d ự n g p h ư ơ n g p h á p đ ể đ ị n h LƯỢNG c á c c h ấ t t r o n g
HOA GẠO
Tiến hành cân chính xác khoảng 0,5000 g cắn hòa tan và định mức thành 25 mL, lọc qua bông và qua màng lọc. Tiến hành sắc ký song song mẫu thử với mẫu hỗn hợp các chất đối chiểu.Tính kết quả theo phương pháp chuẩn hóa 1 điểm.
Lượng cắn cân cho các lần định lượng lần lượt là: 0,5012 g; 0,5018 g và 0,5015 g. Tính toán lượng từng chất có mẫu thử qui về tương đương với 0,5000 g cắn. Tính giá trị trung bình của 3 lần thử. Từ lượng dược liệu và hàm ẩm của nó đem chiết và tổng lượng cắn thu được tính ra hàm lượng từng chất có trong 100 g dược liệu khô.
Kết quả định lượng thu được có trong 100 g hoa Gạo được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.8. Ket quả xác định hàm lượng tìmg chất trong mẫu hoa Gạo nghiên cứu
Lần thử Khối lượng cắn lấy thử (g)
Khôi lượng các họp chât (mg)
Aurantiamid acetat Ergosterol peroxid
Có trong mẫu thử Có trong 0,5 g cắn Có trong mẫu thư Có trong 0,5 g cắn 1 0,5012 1,002 1,000 1,143 1,140 2 0,5018 1,004 1,000 1,144 1,140 3 0,5015 1,003 1,000 1,140 1,140 Trung bình 1,000 1,140 Hàm lượng (mg/100 g dliệu) 10,310 11,755
Vậy lượng aurantiamid acetat và lượng ergosterol peroxid trong 100 g hoa Gạo nghiên cứu lần lượt là 10,310 mg và 11,755 mg. Các giá trị mới chỉ là kết quả sơ bộ vì mới phân tích trên 1 lần chiết xuất của một mẫu hoa Gạo thu hái được. Do vậy cần làm thêm trên số lượng mẫu đủ lớn để có số liệu chính xác hơn về hàm lượng 02 chất trên có trong hoa cây Gạo.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
KẾT LUẬN
Qua thời gian làm luận văn tốt nghiệp, tôi đã thu thập được các tài liệu liên quan đến cây Gạo (Bombax malabaricum DC), kết hợp các điều kiện sẵn có để triển khai thực nghiệm và đã đạt được một số kết quả sau:
1. Đã xây dựng được phương pháp HPLC để định tính và xác định hàm lượng 02 chất aurantiamid acetat và ergosterol peroxid trong hoa Gạo. Điều kiện sắc ký được xác định như sau:
- Cột sắc ký Zorbax C18 (250 mm X 4,6 mm; 5 |im) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30 mm ID).
- Pha động: Acetonitril:methanol (30:70), nhiệt độ 25°c. - Detector UV- VIS, bước sóng phát hiện 280 nm. - Tốc độ dòng là 1,2 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu là 20 )iL.
Phương pháp có độ nhạy cao, tốn ít mẫu thử, có độ đúng và độ chính xác tốt cho kết quả tin cậy. Quá trình phân tích tiến hành khá nhanh chóng và thuận tiện, phù họp với điều kiện hiện nay của các phòng kiểm nghiệm thuốc.
2. Đã áp dụng phương pháp xây dựng trên để xác định được hàm lượng aurantiamid acetat và ergosterol peroxid trong một mẫu hoa Gạo thu hái được. Ket quả sơ bộ như sau: trong 100 g hoa Gạo có chứa 10,310 mg aurantiamid acetat và 11,755 mg ergosterol peroxid.
ĐỀ XUÁT
1. Tiếp tục phân lập và tinh chế thêm aurantiamid acetat và ergosterol peroxid từ hoa của cây Gạo với khối lượng đủ lớn (cỡ hàng gam) để có thể tiến hành thiết lập các chất đối chiếu. Khi có được các chất đổi chiếu này thì việc định tính, định lượng các chất đó trong hoa Gạo và chế phẩm từ hoa Gạo sẽ cho kết quả chính xác và tin cậy hơn.
2. Vì thời gian có hạn nên mới chỉ tiến hành phân tích được trên 01 mẫu hoa của cây Gạo nên chưa có tính đại diện cao, do đó, cần mở rộng nghiên cứu, phân tích ở những mẫu hoa Gạo ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung để có số liệu chính xác hàm lượng các hợp chất trong hoa Gạo.
3. Hoàn thiện phương pháp để có thể góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu cây Gạo
(Bombax malabaricum DC).
4. Tiếp tục áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng các hoạt chất trong hoa Gạo nhằm đánh giá chất lượng hoa thu hoạch vào những thời vụ, địa phương khác nhau trong cả nước.
5. Nghiên cứu tác dụng sinh học của hai họp chất aurantiamid acetat và ergosterol peroxid được chiết xuất từ hoa Gạo. Neu hai hợp chất này có thể ứng dụng trong điều trị, có thể nghiên cứu các dạng bào chế tiện dụng và có hiệu quả điều trị tốt từ hoa Gạo.
Tài liệu tiếng Việt
1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích II, NXB Y học Hà Nội. 2. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội.
3. Bộ Y Tế - Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm Dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, 84-110.
4. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, 508.
5. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học và kỹ thuật, 464-466.
6. Nguyễn Minh Đức (2006), sắc lý lỏng hiệu năng cao và một số úng dụng vào nghiên cứu và kiếm nghiệm dược phấm, dược liệu và họp chất tự nhiên, NXB Y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh, 49-234.
7. Phạm Văn Đức (2012), Chiết xuất, phân lập một sổ thành phần từ hoa cây Gạo,
Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại Học năm 2007- 2012, Trường Đại học Dược Hà Nội.
8. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, quyển I, NXB Trẻ, 514.
9. Phó Thuần Hương (2010), “Cây Gạo chữa nhiều bệnh”, Tạp chí thuốc và sức khỏe, 15.
10. Nguyễn Tiến Khanh (1995), Thống kê ứng dụng trong công tác Dược, Tủ sách sau đại học, Trường Đại Học Dược Hà Nội, 17, 27- 35.
11. Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Khoa Hóa Học Trường ĐHKHTN, Hà Nội.
12. Thái Phan Quỳnh Như (2001), Phưong pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, Tài liệu tập huấn, Viện Kiểm Nghiệm - Bộ Y Tế.
13. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, NXB Khoa học và kỹ thuật, 852-853.
14. Viện Dược liệu (2009), Cây thuốc Nghệ An, NXB Sở Thông tin và truyền thông Nghệ An, 354.
15. Artur Smania Jr.a, Elza F. A. Smaniaa, Franco Delle Monacheb, Moacir G. Pizzolattic, and Giuliano Delle Monachea (2006), “Derivatization Does Not Influence Antimicrobial and Antifungal Activities of Applanoxidic Acids and Sterols from Ganoderma spp”, zNaturforsch c., 62(1-2), 32-33.
16. Bok, J. w „ Lermer, L„ Chilton, J„ Klingeman, H. G. & Towers, G. H. (1999), “Antitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensis”. Phytochemistry,
51, 891-898.
17. Christopher M. Riley (1996), “Deverlopment and validation of analytical method”, Elservier Science inc. New York, U.S.A., 51, 891-898.
18. El-Hagrassi AM., All MM., Osman AF., Shaaban M. (2011), “Phytochemical investigation and biological studies of Bombax malabaricum flowers”, Natural Product Research, 25(2), 141-151.
19. H. Araya, M. Kobayashi, M. Ebina, H. Nakagawa (2003), “Identification of two 5a,8a-epidioxyergosta-3p-ols from the endophyte, Neotyphodium lolii”,
Biochemical Systernatics and Ecology, 31, 1337-1339.
20. Isshiki K. et al (2001), “Aurantiamide acetate, a selective cathepsin inhibitor, produced by Aspergillus peniciUoides'\ Biosci Biotechnol Biochem, 65(5),
1195-1197.
21. Jian-Min Yue, Shao-Nong Chen, Zhong-Wen Lin, Han-Dong Sun. (2001), “Sterols from the fungus Lactarium volemus’\ Phytochemistry, 56(8), 801-806. 22. Joachim RoÈsecke, Wilfried A. KoÈnig (2000), “Constituents of the fungi
Daedalea quercina and Daedaleopsis confragosa var. Tricolor”, Phytochemistry
54, 757-762.
23. Katz E., Eksteen R., Schoenmakers p.. Miller N. (2004), Handbook o f HPLC,
Marcel Dekker Inc.
24. Kirsti Kahios, Kangas L, Hiltunen R (1989), "Ergosterol peroxide, an active compound ĩxom Inonotus radiatus". Planta medica 55 (4), 389-390.
25. Kobori M, Yoshida M, Ohnishi-Kameyama M, Shinmoto H (2007), “Ergosterol peroxide from an edible mushroom suppresses inflammatory responses in RAW264.7 macrophages and growth of HT29 colon adenocarcinoma cells”. Br J Pharmacol, 150(2), 209-219.
derivatives from roots of Moringa oleifera aspotential anti-inflammatory and antinociceptive agents”, European Journal o f Medicinal Chemistry, 44(1), 432 - 436.
27. Kreisel H, Lindequist U, Horak M. Distribution (1990), “Ecology and immunosuppressive properties of Tricholoma populinum (Basidiomycetes)”,
Zentralbl Mikrobiol, 145, 393-396.
28. Kuo Y C, Weng S C, Chou C J, Chang T T, and Tsai W J (2003), “Activation and proliferation signals in primary human T lymphocytes inhibited by ergosterol peroxide isolated from Cordyceps cicadae”, Br J Pharmacol, 140(5), 895-906.
29. QINLING, Li Bogang, GUAN Jiafa & ZHANG Guolin (2007), “ Chemical study on Aspergillus sp”, Chinese Journal o f Applied & Environmental Biology,
13(1), 66- 68.
30. Ravi V., Patel SS., Verma NK., Dutta D., Saleem TSM. (2010),
“Hepatoprotective activity of Bombax ceiba Linn against Isoniazid and Rifampicin-induced toxicity in experimental rats”. International Journal o f Applied Research in Natural Products, 3(3), 19-26.
31. Russo A, Cardile V, Piovano M, Caggia S, Espinoza CL, Garbarino JA. (2010), “Proapoptotic activity of ergosterol peroxide and (22E)-ergosta-7, 22-dien- 5alpha-hydroxy-3, 6-dione in human prostate cancer cells”, Chem Biol Interact,
184(3), 352-358.
32. Said A., Aboutable EA., Nofal SM„ Tokuda H., Raslan M. (2011), “Phytoconstituents and bioactivity evaluation of Bombax ceiba L. flowers”.
Journal o f Traditional Medicines, 28, 55-62.
33. Saleem R., Ahmad SI., Ahmad M., Faizi Z., Rehman S., Ali M., Faizi S. (2003), “Hypotensive activity and toxicology of constituents from Bombax ceiba stem bark”, Biol Pharm Bull, 26(1), 41-46.
34. Shaoping Liand Karl W. K. Tsim, (2004), “The Biological and Pharmacological Properties of Cordyceps sinensis, a Traditional Chinese Medicine That Has Broad Clinical Applications”. Herbal and Traditional Medicine. Biomolecular and Clinical Aspects, 978-0-203-02590-1. DOI: 10.1201/9780203025901, 31.