- Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS 8030 có kết nối thêm detector SPD - 20A (có khả năng phân tích UV- VIS trong vùng 190 - 700 nm) của Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ phẩm Hà Nội.
- Cột sắc ký Zorbax C18 (250 mm; 4,6 mm, 5 í-im) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30 mm ID).
- Máy đo pH 510 CyberScan.
- Cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,01 mg. - Cân kỹ thuật SARTOTIUS.
- Kính hiển vi LEICA CME. - Máy xác định độ ẩm PRECISA.
- Máy cất quay BUCHI ROTA VAPOR R-200. - Máy siêu âm Brasonic (Mỹ).
- Máy khuẩy từ Ikamag (Đức).
- Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45 |jm). - Autopipet 10-100 |a l, 100-1000 |il (Nhật). - Óng Eppendorf.
- Bình định mức, pipet chính xác, cốc có mỏ và các dụng cụ thủy tinh khác... 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u
- Đánh giá tổng tạp có trong các mẫu hợp chất phân lập và tinh chế được bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích.
- Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các hợp chất trong hỗn hợp 2 hợp chất nghiên cứu với nhau và với các họp chất khác trong cao lỏng hoa Gạo.
- Định tính các pic trên sắc ký đồ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với MS kết nối.
- Thẩm định các điều kiện định lượng một số hợp chất trên với chất đối chiếu là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cẩu trúc và xác định tổng tạp bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích.
- Áp dụng phương Dháp HPLC để sơ bộ xác định hàm lượng 2 hợp chất trên có trong mẫu hoa Gạo thu hái được.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử
Muốn định lượng được hoạt chất trong dược liệu nói chung cũng như định lượng được aurantiamid acetat và ergosterol peroxid nói riêng, vấn đề đầu tiên cần quan tâm là lựa chọn phương pháp chiết thích họp. Phương pháp đó phải đảm bảo chiết kiệt được hoạt chất cần định lượng và dịch chiết phải đủ sạch để không làm sai lệch kết quả phân tích. Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp khác nhau, phương pháp ngâm lạnh với methanol được chọn để xử lý mẫu.
*1* Xác định độ ẩm của bột dược liệu bằng máy đo độ ẩm
Hoa sau khi được làm Idiô tự nhiên, nghiền thành bột thô. Lấy khoảng 2g bột mẫu nghiên cứu để xác định độ ẩm của dược liệu. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110°c, rắc bột dược liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình. Đọc kết quả. Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
*x* Chiêt xuất
Cho dược liệu đã chia nhỏ đến kích thước thích họp (thường là bột thô) vào bình kín ngâm với methanol ở nhiệt độ phòng. Sau khi ngâm 24 giờ, gạn, ép dịch chiết, lọc tạp chất. Bã lại được tiến hành ngâm lần 2 với 48 giờ, lần 3 với 72 giờ và xử lý tương tự như lần 1.
Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay BUCHI ROTAVAPOR R-200 để thu được cắn toàn phần. Cân cắn thu được và bảo quản ở 4°c.
**** Tính hiệu suất chiết
Hàm lượng % của cắn toàn phần so với khối lượng bột dược liệu được tính theo công thức sau:
M(lOO-x)
Trong đó: X là hàm lượng (%), M là khối lượng dược liệu đem chiết (g), X là độ ẩm dược liệu (%), a là khối lượng cắn toàn phần thu được (g).
❖ Pha dung dịch thử:
Lấy chính xác khoảng 0,5000 g cắn toàn phần, hòa tan hoàn toàn trong methanol định mức thành 25 mL dung dịch, lọc qua bông thủy tinh, rồi qua màng lọc 0,45 |am truớc khi tiêm mẫu vào hệ thống HPLC.
2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc (chuẩn gốc)
*1* Kiếm tra độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu phân lập điỉợc
- Vì các chất khảo sát đều tan tốt trong methanol nên methanol được chọn làm dung môi để pha dung dịch đối chiếu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Các chất nghiên cứu được cân chính xác, hòa tan và định mức thành các dung dịch trong methanol, lọc qua màng lọc, sau đó tiêm vào hệ thống sắc ký.
- Độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu được đánh giá qua tổng tạp có trong chúng sau khi phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc. Tổng tạp của các hợp chất được đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích.
**** Pha cấc dung dịch đối chiếu gốc (chuẩn gổc)
- Cân chính xác một lượng từng chất nghiên cứu cho vào bình định mức 25 mL, thêm vừa đủ methanol, lắc đều cho tan hoàn toàn. Dung dịch này dùng để kiểm tra tổng tạp và được pha loãng thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn.
2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký
*x* Cột sắc ký
Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp tách chiết, định lượng một số thành phần trong cây Gạo, tôi thấy các phương pháp đều sử dụng sắc ký pha đảo. Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phương pháp được sử dụng khá phổ biến vói nhiều tính ưu việt. Do đó, tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này.
Sử dụng cột hiện có là Cột Zorbax C18 (250 mm X 4,6 mm; 5 |am) kết họp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30 mm ID).
*1* Pha động
Là một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu giữ các chất phân tích và hiệu quả của sự tách sắc ký.
Qua nghiên cứu tính chất lí hóa của các chất và nghiên cứu một sổ tài liệu tham khảo, các dung môi thường sử dụng là methanol, acetonitril, acid formic, nước. Thay đổi tỷ lệ dung môi để có thể thu được sắc ký đồ với các chất được tách riêng rẽ.
2.3.4. Thẩm định phưoTig pháp phân tích [17]
2.3.4.1. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký
Là độ chính xác của thiết bị, được xây dựng bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý xong.
Cách xác định: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuấn đã chuẩn bị ở trên ghi lại thời gian lưu, diện tich pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD.
Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ chênh lệch chuẩn tương đổi (RSD) không lớn hơn 2%.
2.3.4.2. Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của một phương pháp phân tích là khả năng phân biệt và định lượng chất cần phân tích khi có mặt của các thành phần khác trong mẫu. Trên sắc ký đồ của mẫu trắng và các mẫu tự tạo, pic của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các pic tạp.
2.3.43. Khoảng nồng độ tuyến tính, đường chuẩn
Đường chuẩn biễu diễn mối quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ đã biết của chất cần phân tích trong dung dịch.
Khoảng tuyến tính là khoảng từ nồng độ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính.
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b, với hệ số tương quan r.
Cách xác định:
- Chuẩn bị dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên trong khoảng thích hợp. - Tiêm mẫu và tiến hành sắc ký.
- Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r.
23.4.4. Độ lặp lại của phương pháp
Là độ chính xác của tổng thể quá trình phân tích, được biểu thị bằng giá trị RSD% của kết quả phân tích của mẫu độc lập trong cùng một điều kiện phân tích.
Cách xác định:
- Phân tích 1 mẫu 6 lần song song.
- Xác định kết quả định lượng theo đường chuẩn, tiến hành trong cùng điều kiện. - Tính độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
23.4.5. Độ đúng
Độ đúng của một phương pháp phân tích là mức độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết.
Khảo sát độ đúng của phương pháp là dựa vào phương pháp thêm chuẩn. Nguyên tắc của phương pháp là thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào mẫu thử đã được xác định nồng độ sao cho lượng hoạt chất thêm vào và lượng mẫu thử vẫn nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp.
Độ đúng phải được đo tối thiểu tại 3 nồng độ trong khoảng nồng độ khảo sát.
Yêu cầu: Giá trị trung bình thu được ở mỗi nồng độ sai lệch trong khoảng ±15% so với giá trị thực. Ngoại trừ giá trị tại nồng độ LOQ cho phép sai lệch trong khoảng
±20%.
23.4.6. Giói hạn phát hiện (LOD) và giói hạn định lượng (LOQ)
- Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của hoạt chất cần phân tích có trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được.
=> LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó chiều cao pic của hoạt chất gấp 3 lần nhiễu đường nền (S/N = 3).
- Giới hạn định lượng (LOQ) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
=> LOQ được xác định là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó chiều cao pic của hoạt chất gấp 10 lần độ nhiễu đường nền (S/N = 10) và có độ chính xác chấp nhận.
LOQ thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Đáp ứng của chất phân tích phải lớn hơn ít nhất 10 lần đáp ứng của mẫu trắng. - Pic của chất phân tích phải rõ ràng, độ đúng nằm trong khoảng 80 - 120%, độ lặp lại thỏa mãn RSD < 20%.
2.3.5. PhưoTig pháp xử lý kết quả [10]
Các kết quả sắc ký được xử lý bằng các phần mềm Chemstation của thiết bị HPLC.
Sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ với diện tích pic được thiết lập bằng phương pháp bình phương tối thiểu với hệ số tương quan.
Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trung kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Office Excel.
PHẦN III
THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. x ử LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẴU THỬ
3.1.1. Hàm ẩm của dược liệu
Lấy 3 mẫu ngẫu nhiên ở 3 vị trí khác nhau của mẫu dược liệu đem xác định độ ẩm. Kết quả thu được như ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ket quả xác định độ ấm bột hoa Gạo
STT Khôi lưọTig hoa Gạo (g) Độ ẩm (%)
1 2,0080 6,77
2 2,0155 6,84
3 2,0127 6,75
Trung bình 6,79
^ Ket quả: Độ ẩm của bột hoa Gạo là 6,79%.
3.1.2 Hiệu suất chiết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Khối lượng cắn toàn phần
Cân 500,56 g hoa Gạo (có độ ẩm 6,79%) đã được làm nhỏ, ngâm lạnh 3 lần với methanol theo thời gian mỗi lần ngâm lần lượt là 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Thu dịch chiết, lọc, gộp dịch lọc cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được 24,05 g cắn. Cắn được bảo quản ở 4°c.
Thay các giá trị M = 500,56 (g), x= 6,79% và a = 24,05 (g) vào công thức hiệu a.ioo
suất chiết:
M(lOO-x) o Hiệu suất chiết X = 5,16%.
Nhận xét: Vì lượng hoạt chất trong mẫu cần định lượng là rất thấp, do vậy, muốn thu được kết quả chính xác, cần phải có phương pháp chiết và xử lý dịch chiết thích họfp, cũng như thao tác hết sức cẩn thận trong các khâu của quá trình chiết để có thể chiết kiện được hoạt chất nghiên cứu. Xét các điều kiện thực nghiệm hiện có, với đối tượng nghiên cứu là hoa Gạo, một dược liệu chứa các tế bào mỏng manh dễ vỡ,
sử dụng phương pháp ngâm lạnh ]à phù hợp vói các yếu tố thỏa mãn như: dung môi methanol có độ hòa tan tốt các chất cần chiết, có khả năng ngấm sâu vào các mô và hòa tan các hoạt chất trong hoa Gạo, nhiệt độ phòng thích họp, số lần chiết là 3 lần với thời gian đủ lâu, kéo dài, đảm bảo chiết kiệt được aurantiamid acetat và ergosterol peroxid cần nghiên cứu. Mặt khác, đây cũng là phương pháp kinh điển, thuận tiện, thiết bị đơn giản, dễ thực hiện trong phòng thí ngiệm, sẵn có, tốn ít dung môi, hóa chất, ít tạp và ít chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường.
3.2. KHẢO SÁT XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký vói cột hiện có là Cột Zorbax C18 (250 X 4,6 mm; 5 |jm) kết họp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge
15x30 mm ID). Quá trình khảo sát tiến hành ở nhiệt độ phòng là 25°c.
Sử dụng detector SPD-20A, chọn bước sóng phát hiện 280 nm để dung hòa khả năng phát hiện của các hợp chất nghiên cứu.
Kliởi điểm tôi chọn hệ dung môi gồm acetonitril và methanol. Sau khi thử nghiệm với một số tỷ lệ khác nhau của 2 dung môi trong thành phần pha động là acetonitril và methanol, tôi chọn lựa được một chương trình tương đói phù hợp, đủ tách các chất nghiên círn cũng như các pic kJtiác trong mẫu nghiên cứu được chuẩn bị từ hoa cây Gạo. Khảo sát thêm tốc độ dòng và thể tích tiêm mẫu, điều kiện sắc ký được xác định với điều kiện cột sẵn có ở trên như sau:
- Cột sắc ký Zorbax C18 (250 X 4,6 mm; 5 |jm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30 mm ID).
- Sử dụng detector SPD-20A đặt tại bước sóng phát hiện 280 nm. - Pha động; Acetonitril:methanol (30:70) ở nhiệt độ phòng là 25°c. - Tốc độ dòng là 1,2 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu là 20 I^L.
-J _______ 1 . L ,
Hình 3.1. Sắc ký đồ của hôn hợp 2 chất nghiên cứu aurantiamid acetat và ergosterol peroxid
Hĩnh 3.2. Sắc ký đồ của máu thử chuấn bị từ hoa Gạo
Với điều kiện sắc ký và phương pháp xử lý mẫu đã lựa chọn, hai chất được tách nhau rõ ràng, pic tương đối gọn, nhiễu nền thấp, trên sắc ký đồ mẫu thử các chất nghiên cứu tách khỏi các pic khác.
Tiến hành sắc ký với từng họp chất nghiên cứu (hình 3.4 và hình 3.5) và so sánh với sắc ký đồ thu được của hỗn hợp hai chất aurantiamid acetat và ergosterol peroxid, xác định được thời gian lưu của 2 chất trên lần lưọt là 5,303 và 8,235 phút. 3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN c ứ u
Các chất nghiên cứu được cân chính xác và hòa tan thành các dung dịch trong methanol và tiêm vào hệ thống sắc ký.
Thực hiện chương trình sắc ký như mục 3.2, thu được sắc ký đồ của 2 họp chất như ở hình 3.3 và hình 3.4.
triAU
Ì4Ỉ>
Hình 3.3. Sắc ký đỏ ciìa aurantiamid acetat phân lập được từ hoa cây Gạo.
Hình 3.4. sẳc ký đồ của ergosterol peroxidphân lập được từ hoa cây Gạo.
Các sắc ký đồ ở hình 3.3 và hình 3.4 cho thấy cả 2 họp chất đều không xuất hiện pic tạp chất (trong thời gian sắc ký là 20 phút) nên có thể sử dụng các họp chất này làm nguyên liệu để thiết lập chất đổi chiếu. Tuy nhiên do lượng các hợp chất phân lập được còn ít và chưa đủ thời gian cho phép để thiết lập chất chuẩn, do vậy tôi tạm dùng chúng như chất đối chiếu để khảo sát phương pháp định lượng chúng trong hoa Gạo.
3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHÁT NGHIÊN CÚXJ TRONG HOA GẠO
Tiến hành nhận dạng các pic có cùng thời gian lưu trên sắc ký đồ mẫu thử được chuẩn bị từ hoa Gạo và dung dịch hỗn hợp 2 chất nghiên cứu bằng phổ khối lượng với kĩ thuật LC/MS. Chế độ đo: ESI+ với tốc độ khí phun là 3 L/phút, tốc độ khí làm khô là 15 L/phút, nhiệt độ mao quản là 250°c, nhiệt độ của heat block là 400°c,
Ket quả phổ khối lượng hoàn toàn phù hợp (Hình 3.5 và Hình 3.6), do đó góp phần khẳng định thêm các pic tại các thời gian lưu tương ứng là các pic của aurantiamid acetat và ergosterol peroxid. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
i
Hình 3.5. Phổ khối lượng ứng với các pỉc của aurantiamid acetat trên sắc ký đồ của mẫu thử hoa Gạo và hon hợp chất đoi chiếu.
Hình 3.6. Phổ khối lượng ứng vói các pic của ergosterol peroxid trên sắc ký đồ của mẫu thử hoa Gạo và hỗn hợp chất đối chiếu.
Ngoài pic của 2 hợp chất nghiên cứu, trên sắc ký đồ của mẫu thử chuẩn bị từ hoa Gạo còn xuất hiện thêm 3 pic khác ở khoảng 6,9 phút; 13,7 phút và 15,9 phút (Hình