Muốn định lượng được hoạt chất trong dược liệu nói chung cũng như định lượng được aurantiamid acetat và ergosterol peroxid nói riêng, vấn đề đầu tiên cần quan tâm là lựa chọn phương pháp chiết thích họp. Phương pháp đó phải đảm bảo chiết kiệt được hoạt chất cần định lượng và dịch chiết phải đủ sạch để không làm sai lệch kết quả phân tích. Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp khác nhau, phương pháp ngâm lạnh với methanol được chọn để xử lý mẫu.
*1* Xác định độ ẩm của bột dược liệu bằng máy đo độ ẩm
Hoa sau khi được làm Idiô tự nhiên, nghiền thành bột thô. Lấy khoảng 2g bột mẫu nghiên cứu để xác định độ ẩm của dược liệu. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110°c, rắc bột dược liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình. Đọc kết quả. Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
*x* Chiêt xuất
Cho dược liệu đã chia nhỏ đến kích thước thích họp (thường là bột thô) vào bình kín ngâm với methanol ở nhiệt độ phòng. Sau khi ngâm 24 giờ, gạn, ép dịch chiết, lọc tạp chất. Bã lại được tiến hành ngâm lần 2 với 48 giờ, lần 3 với 72 giờ và xử lý tương tự như lần 1.
Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay BUCHI ROTAVAPOR R-200 để thu được cắn toàn phần. Cân cắn thu được và bảo quản ở 4°c.
**** Tính hiệu suất chiết
Hàm lượng % của cắn toàn phần so với khối lượng bột dược liệu được tính theo công thức sau:
M(lOO-x)
Trong đó: X là hàm lượng (%), M là khối lượng dược liệu đem chiết (g), X là độ ẩm dược liệu (%), a là khối lượng cắn toàn phần thu được (g).
❖ Pha dung dịch thử:
Lấy chính xác khoảng 0,5000 g cắn toàn phần, hòa tan hoàn toàn trong methanol định mức thành 25 mL dung dịch, lọc qua bông thủy tinh, rồi qua màng lọc 0,45 |am truớc khi tiêm mẫu vào hệ thống HPLC.
2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc (chuẩn gốc)
*1* Kiếm tra độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu phân lập điỉợc
- Vì các chất khảo sát đều tan tốt trong methanol nên methanol được chọn làm dung môi để pha dung dịch đối chiếu.
- Các chất nghiên cứu được cân chính xác, hòa tan và định mức thành các dung dịch trong methanol, lọc qua màng lọc, sau đó tiêm vào hệ thống sắc ký.
- Độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu được đánh giá qua tổng tạp có trong chúng sau khi phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc. Tổng tạp của các hợp chất được đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích.
**** Pha cấc dung dịch đối chiếu gốc (chuẩn gổc)
- Cân chính xác một lượng từng chất nghiên cứu cho vào bình định mức 25 mL, thêm vừa đủ methanol, lắc đều cho tan hoàn toàn. Dung dịch này dùng để kiểm tra tổng tạp và được pha loãng thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn.
2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký
*x* Cột sắc ký
Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp tách chiết, định lượng một số thành phần trong cây Gạo, tôi thấy các phương pháp đều sử dụng sắc ký pha đảo. Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phương pháp được sử dụng khá phổ biến vói nhiều tính ưu việt. Do đó, tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này.
Sử dụng cột hiện có là Cột Zorbax C18 (250 mm X 4,6 mm; 5 |am) kết họp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30 mm ID).
*1* Pha động
Là một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu giữ các chất phân tích và hiệu quả của sự tách sắc ký.
Qua nghiên cứu tính chất lí hóa của các chất và nghiên cứu một sổ tài liệu tham khảo, các dung môi thường sử dụng là methanol, acetonitril, acid formic, nước. Thay đổi tỷ lệ dung môi để có thể thu được sắc ký đồ với các chất được tách riêng rẽ.
2.3.4. Thẩm định phưoTig pháp phân tích [17]
2.3.4.1. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký
Là độ chính xác của thiết bị, được xây dựng bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý xong.
Cách xác định: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuấn đã chuẩn bị ở trên ghi lại thời gian lưu, diện tich pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD.
Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ chênh lệch chuẩn tương đổi (RSD) không lớn hơn 2%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.4.2. Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của một phương pháp phân tích là khả năng phân biệt và định lượng chất cần phân tích khi có mặt của các thành phần khác trong mẫu. Trên sắc ký đồ của mẫu trắng và các mẫu tự tạo, pic của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các pic tạp.
2.3.43. Khoảng nồng độ tuyến tính, đường chuẩn
Đường chuẩn biễu diễn mối quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ đã biết của chất cần phân tích trong dung dịch.
Khoảng tuyến tính là khoảng từ nồng độ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính.
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b, với hệ số tương quan r.
Cách xác định:
- Chuẩn bị dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên trong khoảng thích hợp. - Tiêm mẫu và tiến hành sắc ký.
- Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r.
23.4.4. Độ lặp lại của phương pháp
Là độ chính xác của tổng thể quá trình phân tích, được biểu thị bằng giá trị RSD% của kết quả phân tích của mẫu độc lập trong cùng một điều kiện phân tích.
Cách xác định:
- Phân tích 1 mẫu 6 lần song song.
- Xác định kết quả định lượng theo đường chuẩn, tiến hành trong cùng điều kiện. - Tính độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng.
23.4.5. Độ đúng
Độ đúng của một phương pháp phân tích là mức độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết.
Khảo sát độ đúng của phương pháp là dựa vào phương pháp thêm chuẩn. Nguyên tắc của phương pháp là thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào mẫu thử đã được xác định nồng độ sao cho lượng hoạt chất thêm vào và lượng mẫu thử vẫn nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp.
Độ đúng phải được đo tối thiểu tại 3 nồng độ trong khoảng nồng độ khảo sát.
Yêu cầu: Giá trị trung bình thu được ở mỗi nồng độ sai lệch trong khoảng ±15% so với giá trị thực. Ngoại trừ giá trị tại nồng độ LOQ cho phép sai lệch trong khoảng
±20%.
23.4.6. Giói hạn phát hiện (LOD) và giói hạn định lượng (LOQ)
- Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của hoạt chất cần phân tích có trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được.
=> LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó chiều cao pic của hoạt chất gấp 3 lần nhiễu đường nền (S/N = 3).
- Giới hạn định lượng (LOQ) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
=> LOQ được xác định là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó chiều cao pic của hoạt chất gấp 10 lần độ nhiễu đường nền (S/N = 10) và có độ chính xác chấp nhận.
LOQ thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Đáp ứng của chất phân tích phải lớn hơn ít nhất 10 lần đáp ứng của mẫu trắng. - Pic của chất phân tích phải rõ ràng, độ đúng nằm trong khoảng 80 - 120%, độ lặp lại thỏa mãn RSD < 20%.
2.3.5. PhưoTig pháp xử lý kết quả [10]
Các kết quả sắc ký được xử lý bằng các phần mềm Chemstation của thiết bị HPLC.
Sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ với diện tích pic được thiết lập bằng phương pháp bình phương tối thiểu với hệ số tương quan. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trung kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Office Excel.
PHẦN III
THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. x ử LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẴU THỬ