13 Caroten Phảnứngvới H2SO4 đặc Không có 14PolysaccharidPhản ứng với Lugol Không có
2.2.2.4. Định tính các phân đoạn
> Định tính bằng phản ứng hoá học
Khi chúng tôi tiến hành định tính các nhóm chất trong cây Cườm rụng cho thấy nhóm chất Aavonoid cho phản ứng dương tính rõ nhất, do đó chúng tôi thử định tính nhóm Aavonoid cắn của 4 phân đoạn chiết. Kết quả được trình bày ở bảng 2.5.
Cắn Phản ứngđặc trưng Kết quả Kết luận
Gành Lá Cành Lá
A Phản ứng Gyanidin
Phản ứng với kiềm _ _ Không Không
Phản ứng với PeClg 5% có có
Phản ứng với AIQ3 3% trong cồn
B Phản ứng Cyanidin ++
Phản ứng vói kiềm _ +++ Không
Có
Phản ứng với FeQ3 5% +++ có
Phản ứng với AlQg 3% trong cồn ++
c Phản ứng Cyanidin Phản ứng với kiềm ++ +++ ++ +++ PhảnứngvớiFea3 5% +++ +++ Có Có
Phản ứng vói AICI3 3% trong cồn ++ ++
D Phản ứng Cyanidin ++ Phản ứng vói kiềm Phản ứng vối PeClg 5% +++ +++ — Có Không có Phản ứng vói AIQ3 3% trong cồn ++
Nhận xét:
Dựa vào kết quả trên cho thấy cắn của phân đoạn ethylacetat có phản ứng của Aavonoid dưofng tính và rõ nhất. Chúng tôi sơ bộ nhận định, trong 4 phân đoạn trên thành phần Aavonoid được tập trung chủ yếu ở phân đoạn ethylacetat. Qua bảng trên chúng tôi thấy Aavonoid có trong cắn c và cắn D của dịch chiết cành, trong cắn B và cắn c của dịch chiết lá cây Cườm rụng.
- Dịch chấm sắc ký: Hoà cắn các phân đoạn A, B, c, D trong dung môi methanol đã chiết được ở trên làm dịch chấm sắc ký.
- Chuẩn bị bản mỏng: Dùng bản mỏng Silicagel G F 2 5 4 (Merck) tráng sẵn được hoạt hoá ở 110° trong một giờ. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hệ dung môi khai triển:
+ Hệ I ; Toluen/Ethylacetat/acidformic/HjO [6 : 5 :1,5 : 1] + Hệ II; Toluen/Ethylacetat/acidformic [ 5 : 4 : 1 ] + Hệ III: Chloroform/Ethylacetat/acidformic [ 4 : 5 : 1 ] + Hệ IV: Chloroform/Methanol /NH3 [50 : 9 : 1] + Hệ V: Qiloroform/Methanol [ 9 : 1 ] + Hệ VI: Toluen/Ethylacetat/Methanol [8 :6 : 1]
- Tiến hành: Bình sắc ký đã được bão hoà dung môi. Chấm dịch sắc ký ở trên lên bản mỏng.
- Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, sấy nhẹ 15 phút cho bay hết dung môi. Bản SKLM được quan sát dưới ánh sáng thường, đèn tử ngoại ở bước sóng 255 nm và 364 nm. Sau đó, hiện màu bằng TT NH4OH đặc.
- Kết quả cho thấy vói hệ dung môi I tách các vết trong 4 phân đoạn rõ nhất, cắn phân đoạn n-Hexan cho 3 vết, cắn phân đoạn Chloroform cho 5 vết, cắn phân đoạn Ethylacetat cho 7 vết, cắn phân đoạn n-Buthanol cho 3 vết. Kết quả được trình bày ở hình 2.12.
ỷẩ, c/
r-\
Hình 2.12: SKLM cắn A, B, c, D trên hệ I (từ trái sang phải)
* Định tính phân đoạn cắn Ethylacetat bằng SKLM
- Định tính phân đoạn Ethylacetat cho thấy phân đoạn này có nhiều vết trên bản SKLM. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát thêm 1 số hệ dung môi khai triển nhằm tìm ra một hệ dung môi tốt nhất để phân lập các chất trong phân đoạn Ethylacetat.
- Hệ dung môi khai triển:
+ Hệ VII:Toluen/ EthylacetaựHsO [ 5 : 4 : 1]
+ Hệ VIII: Chloroform/Ethylacetat/acid formic [ 5 : 7 : 2 ] + Hệ IX: Chloroform/ acid acetic [9:1]
+ Hệ X: Chloroform/Ethylacetat /acid formic/HjO [ 5 : 5 : 1 :1]
Sau nhiều lần triển khai cho thấy hệ X tách tốt nhất, sắc ký đồ được trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6: Kết quả định tính flavonoid trong lá và cành cây loài
E, acuminata R.Browne bằng SKLM trên h ệ X (5 :5 :l:l)
Vết Rf TT hiện mầu NHađăc
Đô đâm • • Màu
VI 0.16 ++ Vàng nâu V2 0.27 +++ Vàng nâu đậm V3 0.35 +++ Vàng nâu đậm V4 0.47 + Vàng nhạt V5 0.58 + Vàng nhạt V6 0.62 ++ Vàng V7 0.70 + Vàng nhạt Chú thích: + : Phản ứng dương tính ; ++: Phản ứng dương tính rõ. +++: Phản ứng dương tính rất rõ.
Nhận xét: Dịch chiết flavonoid toàn phần trong lá và cành cây loài
E. acuminata R. Browne tưofng đối giống nhau, có 7 vết. Trong đó V2 ,V3 đậm nhất sau đó đến V6 và VI.
2.2.2.S. Phân lập các chất trong phân đoạn Ethylacetat
- Sử dụng cắn c thu được từ phân đoạn Ethylacetat chiết từ cành của cây Cườm rụng để tiến hành phân lập.
- Dung môi rửa giải: Chloroform và Methanol vối lượng tăng dần từ 1%-10% Tiến hành sắc ký cột: Hoà tan khoảng 0,2g cắn c bằng một lượng tối thiểu Methanol rồi đưa lên cột. Rửa giải bằng Chloroform : Methanol (0 - 10%). Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm 5ml đã được đánh số, mỗi ống khoảng 2- 2,5ml.
- Từ ống số 20 đến ống số 35 : cho 1 vết V2, gộp các ống này, cất thu hồi dung môi thu được chất V2.
- Từ ống số 40 đến ống số 50: cho 1 vết V3, gộp các ống này, cất thu hồi dung môi thu được chất V3.