Cấu trúc của sản phẩm tổng hợp đã được khẳng định bởi các phương pháp phổ: NMR và MS. Sau đây là bàn luận về dữ liệu phân tích từ các phổ của các sản phẩm này.
3.6.3.1. Về cấu trúc sản phẩm N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl- asimilobini clorid
Phổ khối lượng của sản phẩm cho pic tại m/z = 326,0 ứng với mảnh [M-Cl]+. Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm là C20H24ClNO3 với khối lượng phân tử M = 361,86 đvC.
Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm xuất hiện tín hiệu của 4 hydro nhóm ethylen tại 4,12 ppm, chứng tỏ đã có phản ứng alkyl hóa tại 1 vị trí trên phân tử N-methylasimilobin. Tín hiệu 3,40 ppm cho thấy trong cấu trúc sản
phẩm có nhóm -CH3 gắn với nguyên tử nitơ. Mặt khác, trên vẫn quan sát thấy tín hiệu của nhóm -OH phenol tại 9,84 ppm. Kết hợp với kết quả sơ bộ về độ phân cực của chất trên SKLM, chúng tôi cho rằng, đã xảy ra N-alkyl hóa N-methylasimilobin tạo ra sản phẩm muối amoni bậc 4 ở điều kiện phản ứng N-alkyl hóa (mục 1.3.3-
Chương 3). Các nhóm gắn với nitơ bậc 4 này (C-5, C-6) đều cho độ chuyển dịch hóa học phù hợp tại trường 3,79 ppm (trong khi đó, giá trị này của nuciferin và
Hình 3.8: Sản phẩm phụ của phản ứng
nguyên liệu N-methylasimilobin nằm ở trường mạnh hơn là 2,82-3,19 ppm do nitơ
ở dạng bậc 3).
Các tín hiệu còn lại của bộ khung nuciferin (asimilobin) trong sản phẩm đều xuất hiện trên phổ. Trong đó, proton tại carbon số 11 (H-11) có độ chuyển dịch hóa học trong trường yếu nhất so với các hydro thơm khác (7,94 ppm) dưới dạng doublet với hằng số tương tác 9,0 Hz (ortho với H-10). Proton thơm H-3 đứng độc lập - không tương tác với các vị trí xung quanh - nên cho tín hiệu singlet tại 7,48 ppm. Nhóm methyl gắn với oxy có độ chuyển dịch hóa học là 4,07 ppm dạng sinhglet. Mặc dù SKLM cho kết quả sản phẩm khá tinh khiết, song trên phổ vẫn quan sát thấy tín hiệu các tạp, trong đó có tạp chứa khung nuciferin (aporphin). Điều này thể hiện ở xen phủ các tín hiệu trên phổ trong v ng thơm cũng như v ng liên kết đơn. Dung môi đo phổ cho tín hiệu tại 3,33 (MeOH) và 4,87 (H2O) ppm. Kết quả phân tích các phổ trên cho phép chúng tôi khẳng định 1 sản phẩm thu được từ phản ứng alkyl hóa N-methylasimilobin là N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl- asimilobini clorid.
3.6.3.2. Về cấu trúc sản phẩm N,O-di(2-hydroxyethyl)-N-methyl- asimilobini clorid
Phổ khối lượng của sản phẩm cho pic tại m/z = 370,0 ứng với mảnh [M-Cl]+. Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm là C22H28ClNO4 với khối lượng phân tử M = 405,92 đvC.
Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm xuất hiện tín hiệu của 8 hydro các nhóm ethylen chứng tỏ đã có phản ứng alkyl hóa tại 2 vị trí trên phân tử
N-methylasimilobin. Đó là các tín hiệu tại 4 vị trí 2,96, 3,21, 3,34 và 3,58 ppm ở
dạng triplet với hằng số tương tác trong khoảng là 6,0-7,5 Hz. Độ chuyển dịch hóa học của các nhóm khác gắn với niơ đã khẳng định nguyên tử này tồn tại ở dạng muối ammoni bậc 4: 3,13 ppm (H-2’, N+-CH3), 3,97 (2H, br.s, H-5, N+-CH2-), 4,10 (1H, s, H-6a, N+-CH). Trên phổ không quan sát thấy tín hiệu của nhóm OH phenol của nguyên liệu N-methylassimilobin. Từ các phân tích này, kết hợp với kết quả sơ bộ về độ phân cực của chất trên SKLM khai triển trên hệ dung môi n-butanol : acid
acetic : nước (6 : 2 : 2) (1 vết nằm dưới so với N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl-
asimilobini clorid), chúng tôi cho rằng, có quá trình N,O-dialkyl hóa N-
methylasimilobin ở điều kiện phản ứng đã tiến hành (mục 3.3- Chương 3).
Các tín hiệu còn lại của bộ khung asimilobin trong sản phẩm đều xuất hiện trên phổ. Tương tự trường hợp tách sản phẩm là N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl- asimilobini clorid, mặc dù SKLM cho kết quả sản phẩm thứ 2 khá tinh khiết, song trên phổ vẫn quan sát thấy tín hiệu các tạp trong vùng liên kết đơn. Dung môi đo phổ cho tín hiệu tại 4,90 (H2O) ppm.
Kết quả phân tích các phổ trên cho phép chúng tôi khẳng định sản phẩm thứ 2 thu được từ phản ứng alkyl hóa N-methylasimilobin là N,O-di(2-hydroxyethyl)-N-
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận:
Đã chiết xuất, phân lập, tinh chế được nuciferin từ dược liệu với hiệu suất 0,315%.
Đã demethyl hóa được nuciferin tạo N-methyl-asimilobin với hiệu
suất 83,4%.
Đã tổng hợp được hai dẫn chất N-alkyl hóa của N-methyl-asimilobin
là: N-2-hydroxyethyl-N-methylasimilobini clorid với hiệu suất 28% và N-2-
hydroxyethyl-N-methyl-O-2-hydroxyethylasimilobini clorid với hiệu suất 31,3%. Đã thử tác dụng sinh học của hai dẫn chất N-alkyl hóa và cho kết quả:
N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid thể hiện hoạt tính yếu trên dòng Lu
với giá trị IC50= 96,92 µg/ml. Trong khi N,O-di(2-hydroxyethyl)-N-methyl-
asimilobini clorid không thể hiện hoạt tính trên dòng Lu khi IC50>128 µg/ml.
Đề xuất:
Tiếp tục nghiên cứu quy trình didemethyl hóa và tridemethyl hóa nuciferin nhằm tạo ra các dẫn chất mới khác và thử tác dụng sinh học của chúng để đóng góp vào công cuộc nghiên cứu phát triển các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu.
Tiếp tục nghiên cứu các hướng phản ứng khác để tạo ra các dẫn chất từ sản phẩm N-methyl-asimilobin có tác dụng sinh học hữu ích ứng dụng cho quá
trình điều trị.
Với quy trình N-alkyl hóa N-methyl-asimilobin: nghiên cứu sâu hơn
các điều kiện của phản ứng cũng như quy trình xử lý phản ứng để đưa ra một quy trình đem lại hiệu suất cao hơn.
Nghiên cứu các hoạt tính sinh học khác của sản phẩm N-alkyl hóa N-
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt:
1. Bộ y tế (2009), Dược liệu học, Nhà xuất bản y học, tập 2, trang 116-119. 2. Nguyễn Thị Thu Hường (2014), Nghiên cứu chiết xuất alkaloid toàn
phần và phân lập nuciferin từ lá sen, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại
học Dược Hà Nội.
3. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản
y học, 283-284.
4. Nguyễn Đình Luyện (2009), Kỹ thuật hóa dược I, Trường Đại học Dược Hà Nội, trang 204, 211.
5. Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012), Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế conessin, kaempferol,nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu,
luận án Tiến sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội.
6. Nguyễn Thị Kiều Trang, (2009), Nghiên cứu quy trình điều chế nuciferin
từ lá sen, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội.
7. Lê Văn Truyền (2010), “Một số vấn đề về chiến lược nghiên cứu thuốc từ dược liệu”, Tạp chí dược học, 413, 2-4, 46-51.
8. Nguyễn Đắc Tùng, 2014, “Bán tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số
dẫn chất của Nuciferin”, khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ.
Tiếng Anh:
9. Brunelle D.J (1987), “New Chemistry Catalysis and Applications”, Phase
Transfer Catalysis, p. 38.
10. Ci-ien-Loung Chen, Hou-Min Giang, Ellis B. Cowling, Chi-Yin Huang Hsu, P. Gates. (1976), “Aporphin Alkaloids and Lignans Formed in Response to Injury of Sapwood in Liriodendron Tulipifera”,
Phytochemist, 15, 1165.
309-400.
12. Feutrill G. I. and Mirrington R. N. (1970), “Demethylation of aryl methyl ethers with thioethoxide ion in dimethyl formamide”, Tetrahedron Lettes, 11(16), 1327.
13. Fujimoto, Katsuyoshi, et al. (2013), “Alkaloid constituents from flower buds and leaves of sacred lotus (Nelumbo nucifera, Nymphaeaceae) with melanogenesis inhibitory activity in B16 melanoma cells”, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 21 (3), 779-787.
14. Guinaudeau H, Leboeuf M, Cave A (1975), “APORPHINE ALKALOIDS”, Jounral of Natural Product . 38: pp. 275.
15. Guo, Feng, Li, Shuo, Ma, Zhao-Jian, Yang, Zhong-Duo, Zhang, Xu, Yang, Zhong-Duo, Yao, Xiao-Jun, Du, Juan, Yao, Xiao-Jun, Li, Shuo. (2012), “An aporphin alkaloid from Nelumbo nucifera as an acetylcholinesterase inhibitor and the primary investigation for structure- activity correlations”, Natural Product Research, 26 (5), 387-392.
16. Israilov, IA, Denisenko, ON, Yunusov, MS, Yunusov, SYu (1976) , “Physicochemical and Pharmacological Properties of Alkaloids –
Isoquinoline Alkaloids – Aporphine Alkaloids”, Chemistry of Natural Compound . 12: pp. 716.
17. Johnson, M.A., Reedy, J.D. and Yang, K. (1970), “Synthesis of quaternary ammonium salts”, Handbook of Phase Transfer Catalysis,
(1970)111-134.
18. Eun-Ji Kang, Won-Yoon Chung, and Kwang-Kyun Park (2014),
“Inhibitory effects of liensinine and nuciferine on breast cancer-
associated bone loss”, The Journal of Cancer Research, 74,2418
19. Keith J. Stanger, Jung-Jae Lee, and Bradley D. Smith (2007), “Dramatic Acceleration of the Menschutkin Reaction and Distortion of Halide Leaving-Group Order”, The Journal of Organic Chemistry, 72, 9663–68. 20. Kende A. S, Rizzi J. P. (1981), “A regiospecific synthesis of (±)-decarbo
methoxyaklavinone”, Tetrahedron Letters, 22 (19), 1779.
21. Liu W1, Yi DD2, Guo JL3, Xiang ZX2, Deng LF4, He L5 (2015), “Nuciferine, extracted from Nelumbo nucifera Gaertn, inhibits tumor- promoting effect of nicotine involving Wnt/β-catenin signaling in non- small cell lung cancer”, Journal of Ethnopharmacology.
22. MAKHLOUFIA MOHAMMED, BENAÏSSA TAHAR DERDOUR AÏCHA, HENNI DJAMEL EDDINE (2010), “ Antibacterial Activity of Quaternary Ammonium Salt from Diethylaminoethyl Methacrylate”, E- Journal of Chemistry, 7(S1), S61-S66.
23. Maximilian Tischer, Gabriele Pradel, Knut Ohlsen, and Ulrike Holzgrabe (2012), “Quaternary Ammonium Salts and Their Antimicrobial Potential: Targets or Nonspecific Interactions”, ChemMedChem, 1,22-31.
24. N. Menschutkin (1890), “Beiträgen zur Kenntnis der Affinitätskoeffizienten der Alkylhaloide und der organischen Amine” ,
Zeitschrift für Physikalische Chemie, 589.
25. Nerinckx W. and Vandewalle M. (1990), “Synthesis of quaternary
ammonium salts”, Handbook of Phase Transfer Catalysis, 111-134(18). 26. Neumeyer (John L .Neumeyer), Monica McCarthy, et al. (1973),
“Synthesis Pharmacological Evaluation of (±)-9,10-Dihydroxyaporphin e[(±)-Isoapomorphine] ,(+)- ,(-)- ,and (± )-1,2-Dihydroxyaporphin,and(+ )-1,2,9,10-Tetrahydroxyaporphinf”, Journal of Medicinal Chemistry, 16
(11), 1228-1233.
27. Hoa Nguyen, Nhan Ta, et al (2012), “ Nuciferin stimulates insulin secretion from beta cell-an invitro comparison with glibenclamide”,Journal of Ethnopharmacology, (142),p488-495.
28. P. F. D’ARcY, B.Pharm., Ph.D., M.P.S. and E. P. TAYLOBR.P, harm.,B.Sc., Ph.D., F.R.I.C.(1962), “Quaternary ammonium compounds
in medicinal chemistry ”, J Pharm Pharmacol, 14, 129-46.
Mukherjee. (2006), “Antioxidant activity of Nelumbo nucifera (sacred
lotus) seeds”, Journal of Ethnopharmacology, 104 (3), 322-327.
30. Sridhar K.R. and Bhat R. (2007), “Lotus – A potential nutraceutical source”, Journal of Agricultural Technology, 3 (1), 143-155.
31. Ulas Tezel and Spyros G Pavlostathis (2015), “Quaternary ammonium
disinfectants: microbial adaptation, degradation and ecology”, Current Opinion in Biotechnology , 33,296–304.
32. Yang, Zhongduo; Song, Zhuwen; Xue, Weiwei; Sheng, Jie; Shu, Zongmei; Shi, Yin; Liang, Jibei; Yao, Xiaojun (2014), Medicinal Chemistry Research; vol. 23; nb. 6, p. 3178 – 3186.
33. Yoshiki Kashiwada, et al. (2005), “Anti-HIV benzylisoquinoline
alkaloids and flavonoids from the leaves of Nelumbo nucifera, and structure–activity correlations with related alkaloids”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 13 (2), 443-448.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1 Phổ 1H-NMR của N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (III)
Phụ lục 2 Phổ 1H-NMR giãn rộng của N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl- asimilobini clorid (III)(1)
Phụ lục 3 Phổ 1H-NMR giãn rộng của N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl- asimilobini clorid (III)(2)
Phụ lục 4 Phổ ESI-MS của N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (III)
Phụ lục 5 Phổ 1H-NMR của N,O-di(2-hydroxyethyl)-N-methyl- asimilobini clorid (IV)
Phụ lục 6 Phổ 1H-NMR giãn rộng của N,O-di(2-hydroxyethyl)-N- methyl-asimilobini clorid (IV)(1)
Phụ lục 7 Phổ 1H-NMR giãn rộng của N,O-di(2-hydroxyethyl)-N- methyl-asimilobini clorid (IV)(2)
Phụ lục 8 Phổ ESI-MS của N,O-di(2-hydroxyethyl)-N-methyl- asimilobini clorid (IV)