Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp phổ: Phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR).
Phổ khối lượng phân tử (MS):
Được ghi theo phương pháp ESI tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy LC/MSD Trap - SL và máy LC/MS/MS-Xevo TQ.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - NMR):
Được ghi tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Bruker AV-500MHz, sử dụng dung môi là MeOD với chất chuẩn nội là tetramethylsilan.
Được ghi tại Khoa Hóa - Trường đại học Khoa học tự nhiên, trêm máy Bruker Ascend 500MHz, sử dụng dung môi là D2O với chất chuẩn nội là tetramethylsilan.
2.4.4. Thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng chống ung thư phổi: Tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam theo phương pháp phương pháp MTT.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.
Thử độc tế bào: Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 g/ml; 32 g/ml; 8 g/ml; 2 g/ml; 0,5 g/ml. Bổ xung 200 l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho LU-1. Giếng điều khiển có 200 l dung dịch tế bào 3 x 104 tế bào/ml. Ủ ở 37oC/5% CO2. Sau 3 ngày thêm 50 l MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 37oC/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 l
DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
Cách tính phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition): (OD điều khiển – OD mẫu)
% kìm hãm = x 100 OD điều khiển
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ lá sen
3.1.1. Quy trình chiết nuciferin
Nguyên liệu: 4 kg lá sen được xay nhỏ thành bột.
Quy trình: Bột lá sen được làm ẩm bằng nước vôi trong (ủ trong 24 giờ để thấm đều dược liệu), sau đó chiết nóng bằng dầu hỏa: mỗi mẻ 1kg bột lá sen với 6 lít dầu hỏa ở nhiệt độ khoảng 90-100oC trong 2 giờ. Dịch chiết dầu hỏa được lắc với 1 lít acid H2SO4 0,3 %. Sau đó gạn lấy lớp dầu đổ lại vào chiết tiếp bã lá sen vừa rồi trong 1,5 giờ, lớp dầu thu được tiếp tục chiết với dịch acid trên. Như vậy cứ mỗi kg lá sen sẽ sử dụng 6 lít dầu hỏa và 1 lít H2SO4 0,3 % (chiết 2 lần). Kiềm hóa dịch acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa cho đến pH 8, lọc thu được tủa alkaloid toàn phần, sấy khô ở 70oC.
Khối lượng alkaloid toàn phần thu được từ 4 kg lá sen là 42 g (1%).
3.1.2. Tinh chế nuciferin.
Phương pháp: Sử dụng phương pháp kết tinh lại trong aceton. Tiến hành:
Cứ 10 g alkaloid toàn phần hòa tan nóng hoàn toàn vào 300 ml aceton. Tẩy màu bằng 0,2 g than hoạt (đun nóng, khuấy trong 10 phút) , lọc nóng.
Để lạnh trong 24 giờ. Lọc tinh thể . Kết quả:
Mnuciferin =12,6 g (0,315%).
Cảm quan: Tinh thể màu trắng ánh xanh.
Đo to
nc: 166-167oC.
Độ tinh khiết kiểm tra sơ bộ bằng SKLM: triển khai với hệ dung môi dicloromethan : methanol (9 : 1), chấm một vết dung dịch thử là chất (I), một vết là dung dịch chuẩn Nuciferin. Kết quả cho thấy sản phẩm tinh khiết với Rf = 0,67.
3.2. Bán tổng hợp N-methyl-asimilobin bằng phản ứng demethyl hóa nuciferin nuciferin
3.2.1. Nguyên lý phản ứng
KI có tác dụng tạo ion I- là tác nhân ái nhân có vai trò xúc tác làm tăng tốc độ phản ứng, giảm thời gian phản ứng, đồng thời KI không làm ảnh hưởng tới hiệu suất phản ứng.
3.2.2. Quy trình phản ứng
Chuẩn bị phản ứng: Cho nuciferin (0,48 g, 1,5 mmol), HBr 48% (25 ml) ,
KI (0,28 g, 1,7 mol) vào bình cầu 2 cổ 100 ml, khuấy từ, có thiết bị sục khí N2 và sinh hàn hồi lưu.
Tiến hành phản ứng: hồi lưu hỗn hợp ở nhiệt độ 120 – 125oC trong 3,5 giờ.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Cất sạch dịch trong phản ứng thu được cặn chất
rắn màu vàng. Hòa tan cặn vào 200 ml cồn 96o nóng, xử lý màu bằng than hoạt tính. Bay hơi bớt dịch còn khoảng 50 ml, để lạnh kết tinh thành tinh thể hình kim, mịn. Sau 24 giờ lọc lấy tinh thể, sấy khô ở 70oC.
Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng demethyl hóa nuciferin: Hình 3.2
3.2.3. Khảo sát
Nhận xét: Hai yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới hiệu suất của phản ứng chính là thời gian và lượng HBr đưa vào phản ứng. Cụ thể :
Thời gian:
Nếu thời gian quá ngắn, không đủ để phản ứng xảy ra hoàn toàn, dẫn đến hiệu suất của phản ứng thấp.
Nếu thời gian quá dài, cùng với nhiệt độ cao có thể xảy ra phản ứng oxy hóa hay các phản ứng phụ khác gây khó khăn cho quá trình tinh chế sản phẩm cũng như làm giảm hiệu suất của phản ứng.
Lượng HBr đưa vào phản ứng:
Lượng HBr ảnh hưởng tới thời gian phản ứng và hiệu suất tạo thành sản phẩm. Mặt khác, lượng HBr quá nhiều khiến việc xử lý phản ứng và tinh chế sản phẩm gặp nhiều khó khăn.
Vì vậy, chúng tôi sử dụng sắc ký để theo dõi đều đặn suốt quá trình phản ứng và quyết định khảo sát lượng HBr 48% (ml) ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng. Từ đó đưa ra thời gian cũng như lượng HBr thích hợp.
Kết quả khảo sát được thể hiện ở Bảng 3.1
Bảng 3.1. Khảo sát lƣợng HBr 48% (ml) ảnh hƣởng đến hiệu suất phản ứng
bán tổng hợp N-methyl-asimilobin STT Nguyên liệu (g) VHBr 48% (ml) Thời gian phản ứng (giờ) Hiệu suất (%) tonc (oC) 1 0,2 8 4,0 81 215-219 2 0,2 10 3,5 83,4 214-217 3 0,2 12 3,5 83 214-217 4 0,2 14 3,5 82 214-217 5 0,2 16 3,25 81 214-218
Vậy, với 0,2 g nguyên liệu, lượng HBr cần dùng là 10 ml và phản ứng thực hiện trong 3,5 giờ.
3.2.4. Kết quả:
mII = 0,49 g (hiệu suất 83,4%). tonc = 214-217oC.
Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng: triển khai với hệ dung môi dicloromethan : methanol (9 : 1) chấm một vết dung dịch mẫu là chất chuẩn N-methylasimilobin, vết dung dịch thử là chất II. Kết quả cho thấy
3.3. Tổng hợp N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (III) và N,O-di(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (IV) bằng phản ứng N-alkyl di(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (IV) bằng phản ứng N-alkyl hóa N-methyl-asimilobin
3.3.1. Nguyên lý phản ứng:
3.3.2. Lựa chọn thời gian và dung môi phản ứng
Chúng tôi tiến hành khảo sát dung môi và thời gian phản ứng nhằm đưa ra điều kiện tối ưu của phản ứng và đề xuất một quy trình N-alkyl hóa N-
methylasimilobin thích hợp nhất trong phạm vi nghiên cứu.
Hai dung môi được khảo sát là acetonitril và DMF, thời gian phản ứng được khảo sát cụ thể với từng dung môi.
3.3.2.1. Cách tiến hành khảo sát
Các phản ứng khảo sát được thực hiện với quy trình sau:
Chuẩn bị phản ứng: Bình cầu, 0,1 g chất II (0,28 mmol), 0,8 g K2CO3 (khan) (5,79 mmol) , 15 ml dung môi (sục N2), 0,8 ml 2-cloroethanol (11,9 mmol).
Tiến hành phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất II (0,28 mmol) , 15 ml
dung môi (sục N2). Khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ thích hợp đến khi chất II tan
hoàn toàn, đồng thời sục N2. Sau đó thêm 0,8 g K2CO3 (khan) (5,79 mmol), duy trì nhiệt độ, khuấy và sục N2 trong 20 phút. Thêm 0,8 ml 2-cloroethanol (11,9 mmol).
Hình 3.3: Nguyên lý của phản ứng N-alkyl hóa sử dụng tác
Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi Sắc ký lớp mỏng được khai triển với hệ dung môi dicloromethan : methanol (9 : 1) để xác định thời gian phản ứng thích hợp.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Lọc hỗn hợp phản ứng loại muối vô cơ.
Thêm nước và cloroform vào dịch lọc vừa thu được lắc và chiết lấy pha nước. Thêm nước vào pha hữu cơ để chiết kiệt sản phẩm muối cần lấy, làm như vậy 3 lần. Rửa lại pha nước bằng cloroform. Cất bớt nước đến khi còn lại 5ml, sử dụng sắc ký điều chế để tách lấy sản phẩm.
Sắc ký điều chế tách sản phẩm được tiến hành như sau:
Chấm dung dịch sau xử lý phản ứng chứa 2 hoặc 3 vết lên những bản mỏng có kích thước 20 x 20 cm được tráng chất hấp phụ là silicagel G (Merck), đã hoạt hóa ở 110 oC trong 1 giờ (một bản mỏng cho một phản ứng với 0,1g nguyên liệu). Hệ dung môi khai triển là hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nước ( 6 : 2 : 2).
Bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó soi dưới “đèn soi UV sắc kí CN6” đánh dấu vùng chứa sản phẩm.
Cạo lấy silicagel chứa chất cần tách, phản hấp phụ bằng methanol và lọc lấy dịch. Bay hơi hết dung môi thu được sản phẩm cần tổng hợp.
3.3.2.2. Xác định thời gian phản ứng trong dung môi DMF
a. Đánh giá:
Thời gian phản ứng được xác định bằng cách theo dõi sắc ký lớp mỏng, được khai triển với hệ dung môi dicloromethan : methanol (9 : 1), quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Trên sắc ký lớp mỏng có thể quan sát thấy các vết sau :
Vết nguyên liệu (II): Rf = 0,6.
Vết của sản phẩm N-alkyl hóa (muối amoni bậc 4): nằm ngay trên vết chấm.
Vết của sản phẩm phụ: tất cả các vết không trùng với vết nguyên liệu và sản phẩm.
Phản ứng được coi là hoàn toàn khi không quan sát thấy vết nguyên liệu trên sắc ký lớp mỏng.
Thời gian tối ưu của phản ứng là thời gian tối thiểu trong đó nguyên liệu đã hết và lượng sản phẩm phụ là ít nhất.
b. Kết quả:
Kết quả khảo sát được thể hiện trong Bảng 3.2
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng N-alkyl hóa
được thực hiện trong dung môi DMF Dung môi Nhiệt độ phản ứng (0C) Thời gian ( giờ) Vết các thành phần trên sắc ký lớp mỏng
Nguyên liệu (II) Sản phẩm phụ
DMF 125-130 12 Có (nhiều) Không 16 Có Không 18 Có (ít) Có (ít) 20 Không Có (ít) 22 Không Có (nhiều) c. Nhận xét:
Từ kết quả thu đƣợc trên cho thấy, thời gian tối ƣu của phản ứng N-
alkyl hóa đƣợc thực hiện trong dung môi DMF là 20 giờ.
3.3.2.3. Xác định thời gian phản ứng thực hiện trong dung môi acetonitril
a. Đánh giá:
Tương tự mục 1.3.2.2
b. Kết quả:
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng N-alkyl hóa
được thực hiện trong dung môi acetonitril Dung môi Nhiệt độ phản ứng (0C) Thời gian (giờ) Vết các thành phần trên sắc ký lớp mỏng Nguyên liệu Sản phẩm phụ Acetonitril 80-85 40 Có (nhiều) Không 44 Có (ít) Có (ít) 48 Không Có (ít) 50 Không Có (nhiều) c. Nhận xét:
Từ kết quả thu đƣợc trên cho thấy, thời gian tối ƣu của phản ứng N- alkyl hóa đƣợc thực hiện trong dung môi acetonitril là 48 giờ.
3.3.2.4. So sánh hiệu suất phản ứng trong dung môi acetonitril và dung môi DMF
a. Đánh giá:
Lượng dung môi khảo sát cho mỗi phản ứng là như nhau.
Dung môi được chọn là dung môi khi tiến hành phản ứng đem lại hiệu suất cao hơn.
b. Kết quả:
Kết quả so sánh được trình bày trong Bảng 3.4
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến thời gian và hiệu suất của
phản ứng N-alkyl hóa Dung môi Lượng dung môi (ml) Nguyên liệu (g) Nhiệt độ phản ứng (0C) Thời gian phản ứng (giờ) Khối lượng sản phẩm (g) III IV Acetonitril 15 0,1 80-85 48 0,023 0.034 DMF 15 0,1 110-120 20 0,035 0,043
c. Nhận xét:
Phản ứng đƣợc thực hiện trong dung môi DMF đem lại hiệu suất cao hơn so với phản ứng thực hiện trong dung môi acetonitril.
Kết luận: Dung môi được chọn để tiến hành các phản ứng tiếp theo là DMF và thời gian của phản ứng là 20 giờ.
3.3.3. Đề xuất quy trình phản ứng
Chuẩn bị phản ứng: Bình cầu, 0,1 g chất II (0,28 mmol), 0,8 g K2CO3 (khan) (5,79 mmol), 15,0 ml DMF (sục N2), 0,8 ml EC (11,9 mmol).
Tiến hành phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất II (0,28 mmol), 15,0 ml DMF (sục N2). Khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ 120oC đến khi chất II tan hoàn toàn, đồng thời sục N2. Sau đó thêm 0,8 g K2CO3 (khan) (5,79 mmol) , duy trì nhiệt độ, khuấy và sục N2 trong 20 phút. Thêm 0,8 ml EC (11,9 mmol). Theo dõi qua trình phản ứng bằng SKLM. Kết thúc phản ứng sau 20 giờ.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Lọc hỗn hợp phản ứng loại muối vô cơ. Thêm nước
và cloroform vào dịch lọc vừa thu được lắc và chiết lấy pha nước. Thêm nước vào pha hữu cơ để chiết kiệt sản phẩm muối cần lấy, làm như vậy 3 lần. Rửa lại pha nước bằng cloroform. Cất bớt nước đến khi còn lại 5ml, sử dụng sắc ký điều chế để tách lấy sản phẩm.
3.3.4. Kết quả
Phản ứng được tiến hành theo quy trình đề xuất trên cho kết quả như sau: Thu được 0,035 g chất III với hiệu suất 28% và 0,043 g chất IV với hiệu suất
31,3%.
Thử tinh khiết bằng phương pháp SKLM triển khai trong hệ dung môi n-
butanol : acid acetic : nước (6 : 2 : 2) cho thấy sản phẩm thu được tinh khiết với Rf(V)= 0,64 và Rf(VI)= 0,62. Kết quả phổ MS và 1H-NMR đã chứng minh cấu trúc sản phẩm thu được là đúng.
Hình 3.4: Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng N- alkyl hóa
N-methyl-asimilobin
0,8 ml EC 0,8 G K2CO3 15,0 ml DMF
3.4. Kết quả phân tích cấu trúc của các dẫn chất N-alkyl của N-methyl-asimilobin asimilobin
Cấu trúc của sản phẩm tổng hợp được khẳng định bởi các phương pháp phổ: MS và NMR.
3.4.1. Xác định cấu trúc sản phẩm N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid
Bảng 3.5 và Bảng 3.6 dẫn ra kết quả phân tích phổ khối lượng (phụ lục 4),
phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (phụ lục 1,2,3) của N-(2-hydroxyethyl)-N- methyl-asimilobini clorid.
Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của N-(2-
hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid N-(2-hydroxyethyl)-N- methyl-asimilobini clorid Khối lƣợng phân tử (đvC) Khối lƣợng chính xác(đvC) m/z 361,86 361,14 326,0 ([M-Cl]+)
Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của N-(2-
hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (1H-NMR, 500 MHz, MeOD)
N-(2-hydroxyethyl)-N- methyl-asimilobini clorid Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm), dạng tín hiệu, vị trí hydro Dạng proton 3,40 (3H, s, H-2’) N+-CH3 3,67 (2H, m, H-4) Ar-CH2- 3,79 (5H, m, H-5, H-6a, H-7) Ar-CH2- và N+-CH 4,07 (3H, s, H-1’) O-CH3 4,12 (4H, br. s, H-3’, H-4’) O-CH2- 7,48 (1H, s, H-3) =CH thơm 7,57 (1H, m, H-9) =CH thơm 7,67 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-8) =CH thơm 7,85 (1H, m, H-10) =CH thơm 7,94 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-11) =CH thơm 9,84 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-5’) OH phenol
Ghi chú: s - singlet, br. s - singlet tù, d - doublet, m - multiplet, Ar - nhân thơm.
3.4.2. Xác định cấu trúc sản phẩm N,O-di(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid clorid
Bảng 3.7 và Bảng 3.8 dẫn ra kết quả phân tích phổ khối lượng (phụ lục 8),
phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (phụ lục 5,6,7) của N,O-di(2-hydroxyethyl)-N- methyl-asimilobini clorid.
Bảng 3.7: Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của N,O-di(2- hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid N,O-di(2-hydroxyethyl)- N-methyl-asimilobini clorid Khối lƣợng phân tử (đvC) Khối lƣợng chính xác(đvC) m/z 405,92 405,17 370,0 ([M-Cl]+)
Bảng 3.8: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của N,O-di(2-
hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (1H-NMR, 500 MHz, D2O) N,O-di(2-hydroxyethyl)-N- methyl-asimilobini clorid Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm), dạng tín hiệu, vị trí hydro Dạng proton 2,96 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-4’) O-CH2- 3,13 (3H, s, H-2’) N+-CH3 3,19 (1H, br. s, H-4β) Ar-CH2- 3,21 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-3’) N+-CH2- 3,26 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-7β) Ar-CH2- 3,34 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-6’) O-CH2- 3,50 (1H, br. s, H-4α) Ar-CH2-