3.5.3.1. Thử nghiệm khả năng sinh Catalase
Nguyên tắc: Phát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy tiện.
Lấy một ít vi khuẩn trên đĩa thạch LBA vào que cấy và nhúng vào giọt H2O2. Nếu có bọt khí xuất hiện thì phàn ứng (+) tính, ngược lại - phản ứng (-) tính.
3.5.3.2. Thử nghiệm khả năng sinh oxydase
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrome c oxydase của vi khuẩn. Lấy một chút sinh khối vi khuẩn bôi lên giấy lọc. Nhỏ thuốc thử (N,N,N',N'- tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride), trong vòng 10s nếu có mầu tím thì (+) tính.
3.5.3.3. Thử nghiệm khả năng lên men đường glucose
Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng nguồn cacbohydrate cụ thể kết hợp với môi trường căn bản, có hoặc không có sinh hơi và H2S.
Sử dụng môi trường Triple Sugar Iron Agar Test (TSI). Kết quả như sau: - Đáy ống nghiệm: Màu vàng: glucose dương tính; Màu đỏ/không đổi màu: glucose dương tính; Màu đen: sinh H2S; Vỡ thạch: Sinh hơi từ glucose.
- Mặt nghiêng: Màu vàng: lactose và/hoặc sucrose dương tính; Màu đỏ/không đổi màu: lactose và sucrose âm tính
3.5.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn
3.5.4.1. Phương pháp khuếch tán thạch để xác định hoạt tính Nattokinase (R. Dubey, 2011)
Hoạt tính của Nattokinase được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch chứa fibrin, 5ml dung dịch fibrin thỏ nồng độ 2% (w/v) trong đệm phosphate
(pH=7,4) được trộn 35ml dung dịch agar 2% đã tiệt trùng trong đĩa petri (đường kính 100mm - Độ dày của thạch sẽ là 5mm). Để cố định 30 phút để thạch đông cứng, sau đó sử dụng que đục lỗ thạch tạo các giếng thạch có đường kính 5mm. 100µl dịch nổi ly tâm của dịch lên men vi khuẩn được đưa vào giếng thạch và ủ ở 37o
C trong 18h. Sau đó đo đường kính vòng phân giải để xác định hoạt tính của enzyme. Một đơn vị (U) được định nghĩa là lượng enzyme có trong 25µl dung dịch enzyme có khả năng tạo ra vòng phân giải 1mm2 ở pH 7,4 và nhiệt độ 37o
C trong 18h.
Hoạt tính enzyme = (D2 – 52) * 3,14/16 (U)
3.5.4.2.Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn
Để xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình tổng hợp Nattokinase, chủng vi khuẩn được nuôi lắc (150 vòng/phút) trong 50ml môi trường CM trong bình tam giác 250ml ở 37oC. Sau các khoảng thời gian 12, 24, 36, 48, 72 giờ tiến hành hút 5ml dịch nuôi cấy, cho vào ống Falcon 15ml và ly tâm ở chế độ 6000 vòng/phút, ở 4oC trong 20 phút. Sau đó dịch nổi được sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch.
3.5.4.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn được nuôi lắc (150 vòng/phút) trong 20ml môi trường CM trong bình tam giác 50ml ở 37oC. pH ban đầu của môi trường được điều chỉnh với các giá trị: 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc HCL 1N. Sau 36h nuôi cấy tiến hành ly tâm ở chế độ 6000 vòng/phút, 4oC trong 20 phút. Sau đó dịch nổi được sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch.
3.5.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc (150 vòng/phút) ở nhiệt độ 37o
C trong 20ml môi trường CM có nguồn cacbon (nồng độ 0,1%) như sau:
Môi trường Nguồn cacbon
CM1 Glucose
CM2 Glycerol
CM3 Maltose
CM4 Sucrose
Vi khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường ở 37oC, lắc 150 vòng/phút trong bình tam giác 50ml. Sau 36h nuôi cấy tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy ở 6000 vòng/phút; nhiệt độ 4oC trong 20 phút để loại bỏ sinh khối. Sau đó dịch nổi được sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch.