Việc nghiên cứu enzyme Nattokinase ở nước ngoài rất được chú trọng được nghiên cứu từ rất sớm và ngày càng được quan tâm vì những lợi ích mà nó mang lại.
Trong suốt những năm 1990, các nhà nghiên cứu báo cáo kết quả về các phương pháp khác nhau để của tách và tinh chế Nattokinase và các tài liệu công bố về hoạt tính tiêu sợi huyết của Nattokinase trong In-vitro. Năm 1990, Sumi và công sự, báo cáo hiệu quả của viên nang Nattokinase trong thử nghiệm phân giải huyết khối ở chó [25]. Đã có ít nhất ba nghiên cứu chứng minh hoạt tính của Nattokinase ở chuột [11][12][13].
Một trong những thử nghiệm hấp dẫn trên người tiến hành với 12 tình nguyện viên khỏe mạnh người Nhật Bản [26]. Mỗi người tham gia sử dụng 200 g Natto một lần mỗi ngày trước bữa ăn sáng, tiếp theo là kiểm tra định kỳ plasma trong máu. Sau một khoảng thời gian 2 tuần, mỗi người lại ăn 200 g đậu nành luộc vào trước bữa ăn sáng. Và lại kiểm tra định kỳ plasma trong máu. Chỉ có một biến đổi nhỏ trong kết quả của nhóm kiểm chứng là những người ăn đậu nành luộc. Ngược lại, nhóm ăn natto cho thấy thời gian thủy phân fibrin (euglobulin lysis time-ELT) giảm đáng kể và hoạt độ cao enzyme tiêu sợi huyết tăng sau khi sử dụng natto. Sự cải thiện hoạt tính của plasma tiêu sợi huyết được duy trì với giá trị p <0.005 từ 2 đến 8 giờ sau khi sử dụng.
Đối với các thử nghiệm tương tự,sử dụng hai viên nang chứa 650 mg Nattokinase , ba lần mỗi ngày trong 8 ngày liên tiếp . Máu được lấy mỗi buổi sáng và các thông số tiêu sợi huyết được đo trong huyết thanh và plasma của các đối tượng. Hoạt tính tiêu sợi huyết euglobin trong các đối tượng này tăng dần từ đầu đến ngày thứ tám. Sản phẩm fibrin thủy phân của các đối tượng vào ngày đầu tiên sử dụng cao hơn đáng kể so với mức trước khi dùng .
Trong một thử nghiệm khác trên người, Okamoto và cộng sự đã báo cáo sự hiện diện của chất chống huyết áp cao của natto [21].Nhận định này được lặp lại thành công bởi Murayama và Sumi (1998) [19]. Trong nghiên cứu này nhỏ, Natto đông khô được chiết bằng ethanol 80% rồi cho 5 tình nguyện viên sử dụng. Có 4 trong 5 đối tượng, huyết áp tâm thu trung bình giảm từ 173,8 ± 20,5 mm Hg thành
154,8 ± 12,6 mm Hg và huyết áp tâm trương giảm từ 101,0 ± 11,4 mmHg đến 91,2 ± 6,6 mmHg.
Tóm lại, Nattokinase là chủ đề của ít nhất 17 nghiên cứu từ năm 1986. Hoạt tính của Fibrinolytic đã được xác định rõ ràng trong In-vitro. Năm thử nghiệm hiệu quả trong cơ thể (in vivo ) cũng đã được thực hiện và hai thử nghiệm trên người trong nhóm nhỏ (5-21 đối tượng) và được thực hiện trên cơ sở ngắn hạn [26].
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn trong sản phẩm đồ uống lên men truyền thống Boza của Bulgaria.
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Sản phẩm đồ uống lên men truyền thống Boza của công ty Harmonica, Bulgaria.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh - Khoa CNSH-CNTP – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian tiến hành: Từ tháng 12 năm 2013 đến tháng 6 năm 2014.
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng
3.3.1. Hóa chất
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất Xuất xứ Tên hóa chất Xuất xứ
Peptone Trung Quốc Xanh metylen Trung Quốc
Cao thịt Trung Quốc Lugol Trung Quốc
Cao nấm men Trung Quốc Safranin Trung Quốc
Glucose Việt nam K2HPO4 Trung Quốc
Agar Việt Nam HCl Trung Quốc
KH2PO4 Mỹ Dầu soi Trung Quốc
CH3COONa Trung Quốc NaCl Trung Quốc
MgSO4.7H2O Trung Quốc NaOH Trung Quốc
Tryptone Trung Quốc CaCO3 Việt Nam
3.3.2. Thiết bị sử dụng
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Xuất xứ Tên thiết bị Xuất xứ
Nồi hấp thanh trùng Trung Quốc Cân phân tích Anh
Tủ sấy Đức Máy khuấy từ Đức
Tủ ấm Trung Quốc Máy đo pH Nhật
Box cấy vi khuẩn Mỹ Kính hiển vi Đức
Máy ly tâm lạnh Đức Máy UV-VIS Hàn quốc
Máy lắc Hàn quốc Tủ lạnh Nhật
Máy Voxted Đức Lò vi sóng Mỹ
Các dụng cụ khác được sử dụng trong thí nghiêm bao gồm: micropipette 10- 100µl, 100-1000 µl ( Đức ), đầu côn, bình tam giác, que cấy, que trang, đĩa petri, ống nghiệm, ống phancol, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm,….
3.3.3. Các môi trường sử dụng (Sambrook và Russel, 2006)
- Môi trường cơ bản (CM) dùng để nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tới tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn: KH2PO4 0,5%; K2HPO4 0,1%; MgSO4 0,01%; Casein 0,2%; Sucrose 0,1%; Cao nấm men 0,1%; CaCl2 0,03%; pH 6,8-7,0.
- Môi trường máu thỏ (BAM) dùng để phân lập vi khuẩn tổng hợp Nattokinase: KH2PO4 0,5%; K2HPO4 0,1%; MgSO4 0,01%; Sucrose 0,1%; Cao nấm men 0,1%; Máu thỏ 5%; CaCl2 0,03%; Agar 2%; pH 6,8-7,0.
- Môi trường LBA dùng để phân lập và giữ giống vi khuẩn: Cao nấm men 0,5%; Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; Agar 2%; pH 7,2 - 7,4.
- Môi trường LB dùng để nhân giống vi khuẩn: Cao nấm men 0,5%; Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; pH 7,2 - 7,4.
3.4. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh Nattokinase từ Boza.
- Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn đã phân lập.
- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới hoạt tính sinh Nattokinase của vi khuẩn: thời gian nuôi cấy, pH ban đầu của môi trường nuôi cấy và loại cơ chất.
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1.Phương pháp phân lập
Mẫu Boza được pha loãng đến độ pha loãng 10-6 và cấy trang lên đĩa thạch chứa môi trường LBA. Ủ đĩa ở nhiệt độ 37oC trong vòng 24h, sau đó dựa vào hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào, tiền hành cấy ria liên tiếp lên đĩa thạch LBA để thuần khiết các chủng vi khuẩn. Các chủng thuần khiết được cấy lên môi trường LBA, nuôi 24h ở nhiệt độ 37oC. Sau đó dùng que đục lỗ thạch để lấy vùng vi khuẩn phát triển tốt (0,5cm), đặt lên bề mặt môi trường BAM ủ ở 37o
C. Đo đường kính vòng phân giải sau 18 giờ ủ. Chủng được lựa chọn là chủng có vòng phân giải lớn hơn 1,5cm.
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn
3.5.2.1. Hình thái khuẩn lạc
Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LBA ở nhiệt độ 37o
C trong 24h và đánh giá hình thái khuẩn lạc vi khuẩn với các tiêu chí: Kích thước, hình dạng, màu sắc, bề mặt, ria của khuẩn lạc.
3.5.2.2. Hình thái tế bào
Tiêu bản nhuộm Gram của vi khuẩn được quan sát trên kính hiển vi quang học với vật kính 100X (sử dụng dầu soi). Đánh giá hình dạng, kích thước, cách sắp xếp và khả năng bắt mầu nhuộm Gram.
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn
3.5.3.1. Thử nghiệm khả năng sinh Catalase
Nguyên tắc: Phát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy tiện.
Lấy một ít vi khuẩn trên đĩa thạch LBA vào que cấy và nhúng vào giọt H2O2. Nếu có bọt khí xuất hiện thì phàn ứng (+) tính, ngược lại - phản ứng (-) tính.
3.5.3.2. Thử nghiệm khả năng sinh oxydase
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrome c oxydase của vi khuẩn. Lấy một chút sinh khối vi khuẩn bôi lên giấy lọc. Nhỏ thuốc thử (N,N,N',N'- tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride), trong vòng 10s nếu có mầu tím thì (+) tính.
3.5.3.3. Thử nghiệm khả năng lên men đường glucose
Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng nguồn cacbohydrate cụ thể kết hợp với môi trường căn bản, có hoặc không có sinh hơi và H2S.
Sử dụng môi trường Triple Sugar Iron Agar Test (TSI). Kết quả như sau: - Đáy ống nghiệm: Màu vàng: glucose dương tính; Màu đỏ/không đổi màu: glucose dương tính; Màu đen: sinh H2S; Vỡ thạch: Sinh hơi từ glucose.
- Mặt nghiêng: Màu vàng: lactose và/hoặc sucrose dương tính; Màu đỏ/không đổi màu: lactose và sucrose âm tính
3.5.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn
3.5.4.1. Phương pháp khuếch tán thạch để xác định hoạt tính Nattokinase (R. Dubey, 2011)
Hoạt tính của Nattokinase được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch chứa fibrin, 5ml dung dịch fibrin thỏ nồng độ 2% (w/v) trong đệm phosphate
(pH=7,4) được trộn 35ml dung dịch agar 2% đã tiệt trùng trong đĩa petri (đường kính 100mm - Độ dày của thạch sẽ là 5mm). Để cố định 30 phút để thạch đông cứng, sau đó sử dụng que đục lỗ thạch tạo các giếng thạch có đường kính 5mm. 100µl dịch nổi ly tâm của dịch lên men vi khuẩn được đưa vào giếng thạch và ủ ở 37o
C trong 18h. Sau đó đo đường kính vòng phân giải để xác định hoạt tính của enzyme. Một đơn vị (U) được định nghĩa là lượng enzyme có trong 25µl dung dịch enzyme có khả năng tạo ra vòng phân giải 1mm2 ở pH 7,4 và nhiệt độ 37o
C trong 18h.
Hoạt tính enzyme = (D2 – 52) * 3,14/16 (U)
3.5.4.2.Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn
Để xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình tổng hợp Nattokinase, chủng vi khuẩn được nuôi lắc (150 vòng/phút) trong 50ml môi trường CM trong bình tam giác 250ml ở 37oC. Sau các khoảng thời gian 12, 24, 36, 48, 72 giờ tiến hành hút 5ml dịch nuôi cấy, cho vào ống Falcon 15ml và ly tâm ở chế độ 6000 vòng/phút, ở 4oC trong 20 phút. Sau đó dịch nổi được sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch.
3.5.4.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn được nuôi lắc (150 vòng/phút) trong 20ml môi trường CM trong bình tam giác 50ml ở 37oC. pH ban đầu của môi trường được điều chỉnh với các giá trị: 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc HCL 1N. Sau 36h nuôi cấy tiến hành ly tâm ở chế độ 6000 vòng/phút, 4oC trong 20 phút. Sau đó dịch nổi được sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch.
3.5.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc (150 vòng/phút) ở nhiệt độ 37o
C trong 20ml môi trường CM có nguồn cacbon (nồng độ 0,1%) như sau:
Môi trường Nguồn cacbon
CM1 Glucose
CM2 Glycerol
CM3 Maltose
CM4 Sucrose
Vi khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường ở 37oC, lắc 150 vòng/phút trong bình tam giác 50ml. Sau 36h nuôi cấy tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy ở 6000 vòng/phút; nhiệt độ 4oC trong 20 phút để loại bỏ sinh khối. Sau đó dịch nổi được sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch.
3.5.5. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Giống vi sinh vật được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng LBA ở nhiệt độ 4oC. Sau 2-3 tuần giống vi sinh vật được cấy chuyển một lần để đảm bảo sức sống và ổn định của giống vi sinh vật trong quá trình nghiên cứu.
3.5.6. Phương pháp nhân giống vi khuẩn
Dùng que cấy lấy sinh khối từ ống giống cấy vào môi trường LB, sau đó nuôi lắc (150 vòng/phút) ở nhiệt độ 37oC trong 24h. Sau khi kết thúc thời gian nuôi cấy, mật độ tế bào tăng lên khoảng 108 tế bào/ml sẽ được cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy tiếp theo với tỷ lệ 10%.
3.6. Phương pháp sử lý số liệu
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên men Boza lên men Boza
Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu đồ uống lên men Boza được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1: Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính phân giải máu đông từ Boza STT Chủng vi khuẩn Vòng phân giải (cm)
1 BL1 1,1
2 BL2 -
3 BL3 -
4 BL4 1,7
5 BL5 -
Kết quả phân lập thu được 5 chủng vi khuẩn thuần khiết được ký hiệu lần lượt là BL1, BL2, BL3, BL4, L5. Sau khi cấy các chủng lên môi trường dinh dưỡng chứa máu thỏ BAM, các chủng BL2, BL3, BL5 không tạo vòng phân giải trên đĩa môi trường. Chỉ có 2 chủng BL1 và BL4 có hoạt tính phân giải máu đông, trong đó chủng BL4 có hoạt tính phân giải mạnh (vòng phân giải >1,5cm) và được chọn làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên men Boza lên men Boza
4.2.1. Kết quả nghiên cứu hình thái của vi khuẩn BL4
Kết quả nghiên cứu hình thái của vi khuẩn BL4 được thể hiện trong bảng 4.2
Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn BL4
Chủng Hình dạng,
kích thước Màu sắc Bề mặt Ria
BL4 Hình tròn hoặc gần tròn, trung bình (0,2- 0,3cm) Trắng sữa, không tiết sắc tố
Ướt, có nếp nhăn, bám yếu lên bề mặt môi trường
Ria không đều
Hình 4.1: Hình thái tế bào vi khuẩn BL4
Vi khuẩn BL4 có khuẩn lạc hình tròn hoặc gần tròn, kích thước trung bình từ 2-3mm, màu trắng sữa không tiết sắc tố. Bề mặt khuẩn lạc BL4 ướt, nhăn, dễ bong khỏi mặt thạch. Khuẩn lạc của vi khuẩn BL4 có ria không đều dạng răng cưa.
Tế bào vi khuẩn BL4 có đạng hình que, kích thước 0,8 x 1,5 µm, hai đầu tế bào tròn đều, có khả năng sinh bào tử, phù hợp với các đặc tính của vi khuẩn
4.2.2. Kết quả nghiên cứu đặc tinh sinh hóa của vi khuẩn BL4
Một số những đặc tính sinh hóa cơ bản của vi khuẩn BL4 được đánh giá, kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn BL4
Đặc tính Kết quả đánh giá
Bắt màu nhuộm Gram +
Sinh bào tử +
Sinh catalase +
Sinh oxidase +
Phân giải glucosea
+
Phân giải glucoseb
+
Phân giải lactoseb
-
Phân giải sucroseb
+
Sinh hơi +
Sinh H2S +
Ghi chú: (+): có, phát triển hoặc dương tính; (-): Không, không phát triển hoặc âm tính; (a) Chuyển hóa đường tạo acid; (b): Chuyển hóa đường sinh khí.
Vi khuẩn BL4 có các đặc tính sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn Bacillus, như khả năng sinh catalase, hô hấp hiếu khí, có khả năng chuyển hóa các loại đường và tiết acid ra môi trường, sinh khí H2S. Để có thể xác định loài vi khuẩn BL4 cần có những nghiên cứu bổ sung về các đặc tính sinh hóa khác theo hệ thống phân loại vi
khuẩncủa Bergey hoặc bằng phương pháp sinh học phân tử thông qua phân tích trình tự rDNA 16S của ribosome.
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 Nattokinase của vi khuẩn BL4
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4
Vi khuẩn Bacillus subtilis thường bắt đầu được tổng hợp Nattokinase vào pha sinh trưởng của vi khuẩn và đạt hoạt tính cao nhất ở giữa pha cân bằng (sau 36h nuôi cấy) [5]. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 được thể hiện ở hình 4.2.
Hình 4.2: Biểu đồảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới hoạt tính Nattokinase của vi khuẩn BL4
Qua hình 4.2 cho thấy vi khuẩn BL4 ngay sau 12h nuôi cấy đã tổng hợp Nattokinase và tiết ra môi trường với hoạt tính là 200U. Sau đó hàm lượng Nattokinase tiếp tục tăng lên 350U tại 24h lên men và đạt cao nhất tại 36h lên men. Hoạt tính của enzyme Nattokinase của vi khuẩn BL4 tại thời điểm 36h nuôi cấy là
370U. Sau thời điểm này hoạt tính của Nattokinase giảm mạnh, sau 48h và 60h lên men, hoạt tính của enzyme chỉ bằng 60% so với thời điểm 36h. Điều này cho thấy sự tương đồng về ảnh hưởng của thời gian lên men tới hoạt tính sinh Nattokinase