Phương pháp chuyển gen vào một số giống lúa được tiến hành dựa trên phương pháp chuyển gen lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của Hiei Y và cs (2008) [32]. Có cải tiến phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và
được tiến theo quy trình dưới đây:
: Agrobacterium stock cấy trải trên đĩa Hạt giống YEP (spec 50mg/l + rifam 25mg/l)
Cảm ứng mô sẹo MSD 2-3 ngày 7-10 ngày
Tạo dịch huyền phù AAM- Agro (OD=0,7-1,0) Mô sẹo
Đồng nuôi cấy mô sẹo- Agro AAM-AS 3 ngày
Nhuộm X-gluc
Hình 3.3: Phương pháp biến nạp gen gus vào lúa (Hiei Y và cs, 2008) [34]
Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa ở Việt Nam được tiến hành như sau:
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa
Mẫu hạt lúa chín được sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo phục vụ cho biến nạp gen. Mẫu hạt được rửa bằng nước xà phòng loãng, để ráo nước. Tiến hành bóc bỏ
vỏ trấu của hạt. Sau đó, khử trùng bằng cồn 700C trong 2 phút, tráng nước cất vô trùng 3 lần. Tiếp tục khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút, tráng 5-7 lần bằng nước cất vô trùng. Ngâm mẫu 5 phút trong nước cất vô trùng và để mẫu khô trên giấy thấm vô trùng. Cấy mẫu vào đĩa pettri chứa môi trường tạo mô sẹo. Các thí nghiệm được bố trí theo công thức sau:
- CT1: Môi trường N6 - CT2: Môi trường MS
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mô sẹo tạo thành, màu sắc mô sẹo và chất lượng mô sẹo.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của mộ số giống lúa
Cách tiến hành: sau khi xác định được môi trường tạo mô sẹo theo kết quả ở
thí nghiệm 1, mẫu được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường nền N6 có bổ xung 2,4D theo công thức sau:
CT1 (đ/c): Môi trường nền N6 (không bổ xung thêm 2,4D) CT2: Môi trường nền N6 + 2,4D 1mg /l
CT 3: Môi trường nền N6 + 2,4D 2mg /l CT 4: Môi trường nền N6 + 2,4D 3mg /l
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100 mẫu, cấy 4 đĩa, mỗi đĩa 25 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: số mô sẹo tạo thành, chất lượng mô sẹo.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4D kết hợp với kinetin đến khả năng tạo mô sẹo của mộ số giống lúa
Tiến hành chuẩn bị môi trường cảm ứng tạo mô sẹo theo kết quảở thí nghiệm 1 có bổ sung nồng độ 2,4D tối ưu đã nghiên cứu ở thí nghiệm 2 (2mg/l), kí hiệu môi trường A. Tiến hành bổ sung nồng độ kinetin vào môi trường nuôi cấy và bố trí thí nghiệm theo công thức sau:
CT1 (đ/c): Môi trường A + kinetin 0mg/l CT2: Môi trường A + kinetin 0,1mg/l
CT3: Môi trường A + kinetin 0,3mg/l CT 4: Môi trường A + kinetin 0,5mg/l CT 5: Môi trường A + kinetin 1mg/l
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: số mô sẹo tạo thành, chất lượng mô sẹo.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen gus của một số giống lúa
Tiến hành thí nghiệm tạo mô sẹo theo phương pháp ở thí nghiệm 1và 2. Sau khi mô sẹo được hình thành, tách các mô sẹo ra và tiếp tục nuôi cấy ở 250C trong tối. Thời gian nuôi cấy tạo mô sẹo để lấy mẫu biến nạp được bố trí thí nghiệm theo công thức sau:
- Công thức 1: mẫu tạo mô sẹo 10 ngày tuổi - Công thức 2: mẫu tạo mô sẹo 14 ngày tuổi - Công thức 3: mẫu tạo mô sẹo 17 ngày tuổi - Công thức 4: mẫu tạo mô sẹo 20 ngày tuổi
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp, tỷ lệ mẫu có màu xanh chàm. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, sử dụng kết quảở thí nghiệm 3 để phục vụ cho thí nghiệm 4 .
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ AS đến biến nạp gen
gus của một số giống lúa
Mẫu mô sẹo có độ tuổi phù hợp được lựa chọn ở thí nghiệm 3 sử dụng làm vật liệu biến nạp. Mô sẹo biến nạp theo tốc độ và thời gian thích hợp nhất theo kết quả đã nghiên cứu ở thí nghiệm 4. Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy có bổ sung AS theo công thức sau:
- Công thức 1: không bổ sung AS - Công thức 2: 20mM/l
- Công thức 3: 50mM/l - Công thức 4: 100mM/l
Sau biến nạp đồng nuôi cấy mô sẹo vào môi trường đồng nuôi cấy CCM đã chuẩn bị, mỗi đĩa 10 mô sẹo, nhiệt độđồng nuôi cấy là 250C.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, sử dụng kết quảở thí nghiệm 3 và 4 để phục vụ cho thí nghiệm 5 .
- Đánh giá sự biểu hiện gen gus:
Sau khi lây nhiễm 3 ngày, mẫu cấy được nhuộm với dung dịch X-gluc (Phụ
lục 4) và được ủ 48h ở 370C. Sau đó rửa mẫu với ethanol 96% để loại diệp lục tố
và ghi nhận sự biểu hiện của gen gus. Khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa thí nghiệm được đánh giá thông qua sự biểu hiện tạm thời của gen gus theo
phương pháp của Hiei Y và cs, 2008) [27].
3.6. Chỉ tiêu đánh giá
Chỉ tiêu của các thí nghiệm sau khi theo dõi sẽđược tính toán theo các công thức sau: - Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo: Tỷ lệ mô sẹo tạo thành = ∑ mô sẹo tạo thành x 100 ∑ mẫu vào - Tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sau biến nạp: Tỷ lệ mẫu sống = ∑mẫu sống sau biến nạp x 100 ∑mẫu biến nạp
Khả năng tiếp nhận gen được đánh giá dựa trên tổng số mẫu có biểu hiện màu xanh chàm trong tổng số mẫu kiểm tra và được tính toán theo công thức sau:
Tỷ lệ mẫu biểu hiện gen gus (%) = Mẫu gus+
x 100
∑mẫu nhuộm
Mức độ biểu hiện của gen gus được đánh giá dựa trên vùng biểu hiện và độ đậm của màu xanh chàm. Trong đó:
+++: màu xanh đậm, vùng biểu hiện rộng
++: màu xanh nhạt và vùng biểu hiện trung bình +: màu xanh nhạt, vùng biểu hiện hẹp
Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học bằng phần mềm Excel 2003 và phần mền IRRISTAT 4.0.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN