2.4.1. Phương pháp phân lập, xác định nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao
Phương pháp phân lập, xác định tác nhân gây bệnh được tiến hành theo phương pháp Koch’s Postulates (1876): theo 4 bước
1. Mô tả triệu chứng và nhận dạng chi tiết.
2. Phân lập tác nhân gây bệnh và thông qua đó mô tả và giám định.
3. Lây bệnh nhân tạo tác nhân gây bệnh lên cây/ quả không bị bệnh, quan sát triệu chứng biểu hiện bệnh có giống như mô tả ban đầu không.
4. Phân lập lại tác nhân gây bệnh được lấy từ nguồn đã lây nhiễm. Nó phải giống như nguồn bệnh ban đầu.
a. Phương pháp thu thập mẫu
* Thu thập mẫu đất ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, ĐăkLăk, ĐăkNông:
- Lấy đất quanh vùng rễ của các cây ca cao có triệu chứng điển hình của bệnh thối đen quả.
- Lấy mẫu đất về bốn phía của cây, gạt nhẹ lớp đất mặt (5cm) sau đó lấy sâu xuống khoảng 15 - 20cm.
- Mỗi điểm chọn 3 cây, mỗi cây lấy 4 mẫu, mỗi mẫu khoảng 1kg đất, trộn đều vào nhau, lấy ra 1kg đất/ cây, trộn đất ở 3 cây vào nhau, sau đó lấy 1kg/ mẫu đất mang về phòng thí nghiệm.
* Thu thập mẫu bệnh:
- Thu thập tất cả các loại triệu chứng bệnh hại trên tất cả các bộ phận của cây liên quan đến bệnh thối đen quả ca cao.
- Các mẫu bệnh được đựng trong ống tuýp hoặc các túi xi măng, giấy báo để trong hộp xốp lạnh. Sau khi thu thập được gửi hoặc mang ngay về phòng thí nghiệm để giám định.
- Cần ghi rõ các thông tin của mẫu:
+ Ngày, địa điểm thu mẫu, tên của chủ ruộng lấy mẫu.
+ Cây trồng (giống, tuổi cây, lịch sử của cây, những cây trồng cùng) + Bộ phận cây bị hại
+ Đất đai (đất đỏ, đất đồi, đồng bằng, thung lũng…), quản lý (phân bón, thuốc trừ sâu bệnh, vệ sinh đồng ruộng…).
b. Phương pháp phân lập nấmPhytophthorapalmivora
Phương pháp phân lập Phytophthora từ bộ phận cây bệnh bằng sử dụng mồi bẫy (một số loại quả như: đu đủ, ca cao, táo, lê …thường phải xanh), [17].
- Phân lập từ đất cây bị bệnh quanh vùng rễ
+ Chọn đất ẩm trên bề mặt 5 cm của lớp đất dưới lớp rác lá, trong đó có rễ cây. + Đục những lỗ nhỏ bán kính 2 cm trên vỏ xanh quả ca cao hoặc các quả cây khác. + Trét đất ẩm vào các lỗ này.
+ Bọc quả trong túi nilon và đặt trong điều kiện phòng.
+ Kiểm tra quả hàng ngày nếu là Phytophthora thì phần thương tổn màu nâu lan rộng nhưng không thối nhũn.
+ Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn.
- Phân lập từ mô cây bệnh: cũng bẫy tương tự như từ đất bị bệnh. + Chọn mô nằm ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ.
+ Thanh trùng bề mặt bằng ethanol 70% hoặc HgCl2 (1%) khoảng 30 - 60 giây. Rửa sạch với nước cất và lau khô bằng giấy đã được khử trùng.
+ Cắt mô thành miếng nhỏ (< 5 mm).
+ Thanh trùng bề mặt quả trái cây, rạch quả và chèn mô bệnh đã thanh trùng vào. + Bọc quả mồi bẫy vào trong túi ni lon để trong nhiệt độ phòng.
+ Kiểm tra túi ủ hàng ngày, sau 2 - 3 ngày thấy vết thương tổn màu nâu lan rộng chứng tỏ có bị nhiễm Phytophthora.
+ Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn môi
trường phân lập.
2.4.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo để xác định độc tính gây bệnh của nấm Phytophthora palmivora trên quả ca cao
Nguồn nấm thuần được nuôi cấy trên môi trường, tạo bào tử nang và du động bào tử bằng phương pháp cắt sợi, cạo bề mặt nấm. Cho nước cất vô trùng, để ở điều kiện 40C trong 2 giờ, sau đó để ở nhiệt độ phòng 24 giờ, kiểm tra mật độ bào tử. Lây dung dịch nấm với nồng độ 1% lên quả ca cao. Theo dõi tỷ lệ bệnh, thời gian tiềm dục của bệnh để xác định tác nhân gây bệnh và độc tính của chúng.
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học, sinh thái của nấm P. palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao
- Thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm hình thái: nấm Phytophthora được cấy trên môi trường PCA (potato carot agar) trong 7 ngày. Dùng dao mổ vô trùng cắt tản nấm thành các mảnh nhỏ (~ 1 cm). Các mảnh nhỏ được chuyển sang đĩa petri mới vô trùng. Kích thích nấm sinh bào tử bằng bổ sung 20 ml nước cất vô trùng vào mỗi đĩa, để ở điều kiện 40C trong 2 giờ, sau đó đặt trong tối ở điều kiện 25oC. Theo dõi sau 1 tuần khả năng hình thành bào tử. Hộp petri đã mọc bào tử, khêu lên lam kính và đo dưới kính hiển vi quang học:
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
+ Sợi nấm phồng,
+ Cách hình thành cành sinh bào tử, + Hình dạng bào tử,
+ Kích thước bào tử + Sự rụng của bào tử,
+ Đường kính lỗ giải phóng bào tử, + Sự hình thành, kích thước hậu bào tử.
- Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm P. palmivora:
Nhân nuôi nấm, sau đó cấy truyền nấm sang hộp petri có chứa các loại môi trường khác nhau: CA, PCA, PDA, CMA, Czapek, V8 Juice.
- Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng về nhiệt độ với nấm P. palmivora
- Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng khác nhau đến sinh trưởng phát triển của nấm P. palmivora:
Thí nghiệm bao gồm các công thức: tối liên tục, sáng liên tục, 12 giờ sáng xen kẽ 12 giờ tối liên tục.
- Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các độ pH khác nhau đến sinh trưởng của nấm P. palmivora: các ngưỡng pH làm thí nghiệm là 4,5; 5; 6; 7; 8.
Cách tiến hành: nấu môi trường CA (Ca rốt + agar) cho vào các bình tam giác ứng với các ngưỡng pH trên, hấp ở nhiệt độ 121oC, thời gian 20 phút. Sau khi hấp xong mang chuẩn bằng máy đo pH. Khi được các ngưỡng pH cần thí nghiệm đem đổ ra đĩa petri để cấy truyền nấm lên trên.
* Các chỉ tiêu chung cho 4 thí nghiệm trên
+ Môi trường nuôi cấy nấm: PCA, PDA. + Đặt điều kiện nhiệt độ: 25oC.
+ Mỗi công thức thí nghiệm làm 3 lần nhắc lại, mỗi lần 5 đĩa petri.
+ Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tốc độ phát triển của nấm ở các ngày thứ 2, 4, 6 sau khi cấy bằng cách đo đường kính tản nấm.
2.4.4. Phân lập và tuyển chọn một số vi sinh vật đối kháng nấm P. palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao trong điều kiện phòng thí nghiệm
a. Thu thập mẫu và phân lập các vi sinh vật đối kháng
- Thu thập mẫu: các mẫu rễ và đất vùng rễ được thu ở độ sâu 15 - 20cm xung quanh vùng rễ của cây không bị bệnh, sinh trưởng và phát triển tốt trong khu vực có sự hiển diện của bệnh do nấm Phytophthora gây nên. Mẫu được thu thập tại các vườn trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông.
- Phân lập nấm Trichoderma
Các mẫu rễ được rửa sạch qua vòi nước và khử trùng bề mặt bằng cồn 95o trong 30 giây sau đó rửa bằng cồn 75o trong 2 phút, cuối cùng rửa sạch lại 3 lần bằng nước cất khử trùng và cấy vào môi trường TME, CMA và PRBA.
nước cất khử trùng đến mức 100 ml, lắc 30 phút, lấy 10ml dung dịch chuyển sang tuýp chứa 90ml nước cất khử trùng, được dung dịch có nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành các bước như trên để có dung dịch với nồng độ pha loãng 10-3. Chuyển 0,5ml dung dịch có nồng độ 10-3 sang hộp petri có chứa môi trường TME, chan đều dung dịch và để các hộp Petri trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC. Kiểm tra sự sinh trưởng và phát triển của các VSV phân lập hàng ngày. Khi nấm sinh trưởng thì tách dòng thuần, tiến hành tách đơn bào tử chuyển sang môi trường dinh dưỡng phù hợp và bảo quản để thực hiện các thí nghiệm sau này.
- Phân lập vi khuẩn theo phương pháp nghiên cứu về vi khuẩn học của Wen- Chuan Chung và cs (2011) [58]. Mẫu đất đã được thu thập về hong khô trong mát khoảng 6 tiếng. Cân 1 gam đất cho mỗi lần lặp lại, mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần. Cho 1 gam đất vào bình tam giác hoặc ống tuýp lắc đều trên máy lắc trong 30 phút. Sau đó pha loãng mẫu ở các nồng độ và phân lập trên môi trường đặc hiệu cho từng loại vi sinh vật. Để trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC trong 4 - 7 ngày, theo dõi số khuẩn lạc sau phân lập. Tách thuần các chủng đã phân lập cấy truyền trên môi trường đặc hiệu.
Môi trường phân lập vi khuẩn: King B, PSA, NA Môi trường bảo quản vi khuẩn: Skim milk
b. Xác định khả năng đối kháng của các vi sinh vật có ích với nấm gây bệnh
- Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp.với nấm P. palmivora:
+ Môi trường thí nghiệm: PDA
+ Phương pháp tiến hành: cấy đối xứng hai bên + Chỉ tiêu theo dõi: đường kính ức chế của tản nấm
- Khả năng ức chế của nấm Trichoderma sp. đối với nấm P.palmivora bằng chất kháng sinh bay hơi: dựng 2 đĩa có đường kính bằng nhau, trên môi trường Czapek, một đĩa cấy nấm gây bệnh, một đĩa cấy nấm Trichoderma sp., úp 2 đĩa vào nhau và giữ kín hộp đĩa. Đối chứng là cặp Petri cấy nấm gây bệnh. Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của từng loại nấm và khả năng ức chế nấm gây bệnh bởi chất kháng sinh bay hơi do nấm Trichoderma sinh ra.
- Hoạt tính đối kháng của vi khuẩn có ích với nấm P. palmivora được đánh giá theo phương pháp của Wen-Chuan Chung và cs (2011) [58]. Nấm Phytophthora đã được cấy thuần, sử dụng đục lỗ đục trên mặt thạch, cấy miếng nấm vào giữa hộp đĩa Petri. Sau đó dùng que cấy khuẩn vạch 2 đường đối xứng, dài khoảng 3 cm hai bên nấm Phytophthora
đã cấy. Theo dõi sự phát triển của nấm bệnh Phytophthora, đo đường kính tản nấm sau cấy từ 4 ngày đến 10 ngày. Mỗi công thức tiến hành 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 5 đĩa.
2.4.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và sinh hóa của một số nấm Trichoderma sp. có khả năng đối kháng cao với nấm P. palmivora
2.4.5.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, nhiệt độ đến sự phát sinh, phát triển của nấm Trichoderma sp.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy: nấm được cấy trên một số môi trường thích hợp với nấm đối kháng PDA, CMA, Czapek. Sau đó được đặt ở điều kiện nhiệt độ: 25oC. Theo dõi đường kính sợi nấm sau 2; 3; 5 ngày nuôi cấy, thời gian xuất hiện bào tử nấm và đếm số lượng bào tử nấm/ ml.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của độ pH: nấm được cấy trên môi trường PDA, với các ngưỡng pH: 4; 5; 6; 7. Cách tiến hành: nấu môi trường PDA cho vào các bình tam giác ứng với các ngưỡng pH trên, hấp ở nhiệt độ 121oC, thời gian 20 phút. Sau khi hấp xong mang chuẩn bằng máy đo pH. Khi được các ngưỡng pH cần thí nghiệm đem đổ ra đĩa petri để cấy truyền nấm lên trên. Theo dõi đường kính sợi nấm sau 1; 2; 3 ngày nuôi cấy, thời gian xuất hiện bào tử nấm và đếm số lượng bào tử nấm/ ml.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ: nấm được cấy trên môi trường PDA có độ pH thích hợp đã được xác định và đặt ở nhiệt độ: 15; 20; 25; 30; 35; 400C. Theo dõi đường kính sợi nấm sau 2; 4; 6 ngày nuôi cấy, thời gian xuất hiện bào tử nấm và đếm số lượng bào tử nấm/ ml.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng: nấm được cấy trên môi trường PDA, được tiến hành với 3 điều kiện chiếu sáng: tối liên tục, sáng liên tục, 12 giờ sáng xen kẽ 12 giờ tối liên tục. Theo dõi đường kính sợi nấm sau 1; 2; 3 ngày nuôi cấy, thời gian xuất hiện bào tử nấm và đếm số lượng bào tử nấm/ ml.
2.4.5.2. Phương pháp định tính hoạt độ enzyme chitinase, β-glucanase và cellulase của nấm Trichoderma
Hoạt độ các enzyme chitanase, ß-glucanase và cellulase của nấm
Trichoderma được định tính bằng phương pháp đo đường kính vòng phân giải trên môi trường cảm ứng tổng hợp của từng loại enzyme [58].
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase và β - glucanase:
Urê 0,3g (NH4)2SO4 1,4g MgSO4.7H2O 0,3g CaCl2.6H2O 0,3g Glucose 0,5g β- Glucan 2g
hoặc huyền phù chitin 10g Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+ 0,1% (v/v)
Nước cất 1lít
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme cellulase:
K2HPO4 2 g
(NH4)2SO4 2g
NaCl 2 g
MgSO4. 7H2O 2 g
Agar 15g
CMC (cacboxyl methyl cellulose) 10g
(Tinh bột tan 0,2% đối với thí nghiệm phân giải tinh bột)
Nước cất 1lít
pH 7,0- 7,2.
- Phương pháp tiến hành: đổ môi trường vào đĩa Petri, cấy nấm Trichorderma
trên môi trường (phương pháp thỏi thạch), đặt ở nhiệt độ thích hợp, quan sát vòng phân
giải cellulase được tạo ra quanh vết cấy bằng dung dịch thuốc thử Lugol.
* Bảo quản và lưu giữ các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với tác nhân gây bệnh.
- Phương pháp 1: Lưu giữ nguồn trên giấy, nấm được giữ trên các mẩu giấy vô trùng, hút chân không trong 14 ngày sau đó bảo quản trong tủ lạnh sâu – 20oC.
- Phương pháp 2: Giữ nấm trên môi trường được bảo quản trong tủ lạnh thường ở 5 -10oC.
2.4.6. Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn đối kháng với nấm P. palmivora
2.4.6.1. Phương pháp xác định khả năng lên men yếm khí của các chủng vi khuẩn đối kháng với nấm P. palmivora
- Môi trường chọn lọc: Peptone (2g), NaCl (5g), KH2PO4 (0.3g), Agar (3g), Bromthymol blue (1%) (3ml), H20 (1l), pH (7.1).
- Phương pháp tiến hành: Đổ 5ml môi trường vào ống nghiệm, hấp khử trùng 1210C trong 20 phút, thêm 0,5 ml Glucose 10% vào mỗi ống nghiệm, cấy mỗi chủng vi sinh vật vào 2 ống, bổ sung 1 lớp dày khoảng 5mm paraffin (đã hấp khử trùng) để tạo điều kiện kị khí sau đó để ở điều kiện nhiệt độ 28oC. Nếu có sự chuyển màu từ xanh sang đỏ ở cả 2 ống nghiệm thì đó là vi khuẩn lên men yếm khí.
2.4.6.2. Phương pháp thử khả năng khử Nitrat của các chủng vi khuẩn đối kháng
. Môi trường chọn lọc: Nước thịt pepton (1l), KNO3 (10 g), pH = 7,0-7,6
. Chuẩn bị thuốc thử Griess:
Dung dịch A: Acid sulfanilic 0,5 g Acid acetic loãng (khoảng 10%) 150 ml.
Dung dịch B: Alpha Naphtylamin 0,1 g Nước cất 20 ml Acid acetic loãng (khoảng 10%) 150 ml.
. Chuẩn bị thuốc thử Diphenylamin: Diphenylamin 0,5 g
H2SO4 đặc 100 ml Nước cất 20ml.
Phương pháp tiến hành: đổ môi trường vào các ống nghiệm (4 - 5 ml/ống), khử trùng ở 121oC trong 15 - 20 phút. Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào môi trường (mỗi chủng cấy 2 ống), đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1, 3, 5 ngày. Chọn 2 ống
không cấy vi khuẩn để làm đối chứng. Sau đó bổ sung vào các ống nghiệm lần lượt các dung dịch, 1 giọt dung dịch A và 1 giọt dung dịch B.
Đánh giá kết quả:
Nếu dịch nuôi cấy chuyển màu (đỏ, hồng, da cam hay nâu) là biểu thị có nitơrit, tức là vi khuẩn có khả năng khử Nitrat.
Nếu dịch nuôi cấy không chuyển màu, thêm 1 - 2 giọt thuốc thử Diphenylamin để kiểm tra sự có mặt của Nitrat (chuyển màu xanh lam là có Nitrat chứng tỏ vi khuẩn không khử Nitrat, không chuyển màu tức là Nitrat đã được khử hết và nitơrit được khử tiếp tục thành các chất khác như N2).
2.4.6.3. Phương pháp xác định khả năng đồng hóa nguồn các bon từ đường Glucose, Sacarose, tinh bột tan (Starch) và rượu Mannitol của các chủng vi khuẩn đối kháng nấm P. palmivora có triển vọng
- Môi trường khoáng cơ bản (g/l):(NH4)2SO4 (2 g), MgSO4.7H2O (0,2 g), NaH2PO4.H2O (0,5 g), CaCl2.2H2O (0,1 g), K2HPO4 (0,5 g), Nước cất (1l).
Các nguồn carbon được dùng trong thí nghiệm
Đường 6C Glucoza
Đường kép Sacarose - Đường kính Đường đa Tinh bột tan (Starch) Rượu bậc 6 Mannitol
- Phương pháp tiến hành: bổ sung nguồn các bon vào môi trường khoáng cơ bản (tinh bột 0,2%), chia môi trường vào các ống nghiệm rồi hấp khử trùng. Lấy vi
