Các thí nghiệm sử dụng các hóa chất, dụng cụ và thiết bị chuyên môn dùng trong nghiên cứu vi sinh vật học.
2.2.1. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường phục vụ cho phân lập, nuôi cấy, giám định mẫu bệnh, thành phần (trong 1 lít môi trường):
+ Môi trường PSM: cà rốt 20g; khoai tây 20g; agar 15g và các hóa chất: Pimaricin 10µg/ml; Rifampicin 20µg/ml; Hymexazol 0,3µl/ml.
+ Môi trường PCA: khoai tây 20g; cà rốt 20g; agar 20g
+ Môi trường PDA: khoai tây 200g; đường dextro 20g; agar 20g + Môi trường CA: cà rốt 200g; agar 15g
+ Môi trường CMA: bột ngô 60g; agar 20g
+ Môi trường Czapek: NaNO3 2g; KH2PO4 1g; MgSO4.7H2O 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4.7H2O 0,01g; sucrose 30g; agar 20g.
+ Môi trường WA: agar 20g
+ Môi trường V8 Juice: V8 200ml; CaCO3 3g ; agar 20g.
- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật đối kháng: Thành phần (trong 1 lít môi trường) + Môi trường PDA: khoai tây 200g; đường dextro 20g; agar 20g
+ Môi trường LB: tryptone 10g; yeast extract 5g; NaCl 5g; agar 20g
+ Môi trường King’B: Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5ml; K2HPO4
(12,5 %) 12ml; MgS04.7H20 (6,25 %) 25ml; agar 20g
+ Môi trường PSA: Saccharoza 20g; Pepton 5,0g; K2HPO4 0,5g; MgSO4.7H2O 0,25g; agar 20g
+ Môi trường NA: nutrient agar 23g.
- Môi trường bảo quản Skim milk: Skim milk 10g; L-glutamic 1,5g; nước cất 100ml.
2.2.2. Các trang thiết bị và dụng cụ
Máy PCR, máy điện di, máy ly tâm, máy đọc UV, máy Vortex , lò vi sóng , hộp Petri, ống nghiệm, ống đong, cốc thủy tinh, bình tam giác, que cấy, panh, dao, kéo, đèn huỳnh quang, tủ lạnh, tủ sấy, nồi hấp, tủ định ôn, kính hiển vi quang học, kính lúp soi nổi, pipetman và đầu côn các loa ̣i , thiết bị đo nhiệt độ, ẩm độ... và các thiết bi ̣ thí nghiê ̣m khác.
2.2.3. Nguồn vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
Chúng tôi lựa chọn các nguồn nấm bệnh: gồm các mẫu quả, đất vùng rễ của những cây bị bệnh thối đen quả ca cao, các nguồn vi sinh vật đối kháng: gồm các mẫu rễ và đất vùng rễ của cây ca cao khỏe không bị bệnh thu thập trên đồng ruộng tại:
- Thôn Eatu, xã Eana, huyện Krông Ana, tỉnh ĐăkLăk;
- Vườn thực vật, Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên; ĐăkLăk; - Huyện Krông Pak, tỉnh ĐăkLăk;
- Nông trường ĐăkLao, Đăk Mil, Đăk Nông;
- Xã Minh Hưng, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước; - Tổ 1 khu 5, Phường Thác Mơ, Phước Long, Bình Phước - Ấp 5, xã Tân Hưng, Đồng Phú, Bình Phước.
2.3. Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh cây - Viện Bảo vệ thực vật, Phường Đức Thắng, Quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân lập, xác định nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao
Phương pháp phân lập, xác định tác nhân gây bệnh được tiến hành theo phương pháp Koch’s Postulates (1876): theo 4 bước
1. Mô tả triệu chứng và nhận dạng chi tiết.
2. Phân lập tác nhân gây bệnh và thông qua đó mô tả và giám định.
3. Lây bệnh nhân tạo tác nhân gây bệnh lên cây/ quả không bị bệnh, quan sát triệu chứng biểu hiện bệnh có giống như mô tả ban đầu không.
4. Phân lập lại tác nhân gây bệnh được lấy từ nguồn đã lây nhiễm. Nó phải giống như nguồn bệnh ban đầu.
a. Phương pháp thu thập mẫu
* Thu thập mẫu đất ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, ĐăkLăk, ĐăkNông:
- Lấy đất quanh vùng rễ của các cây ca cao có triệu chứng điển hình của bệnh thối đen quả.
- Lấy mẫu đất về bốn phía của cây, gạt nhẹ lớp đất mặt (5cm) sau đó lấy sâu xuống khoảng 15 - 20cm.
- Mỗi điểm chọn 3 cây, mỗi cây lấy 4 mẫu, mỗi mẫu khoảng 1kg đất, trộn đều vào nhau, lấy ra 1kg đất/ cây, trộn đất ở 3 cây vào nhau, sau đó lấy 1kg/ mẫu đất mang về phòng thí nghiệm.
* Thu thập mẫu bệnh:
- Thu thập tất cả các loại triệu chứng bệnh hại trên tất cả các bộ phận của cây liên quan đến bệnh thối đen quả ca cao.
- Các mẫu bệnh được đựng trong ống tuýp hoặc các túi xi măng, giấy báo để trong hộp xốp lạnh. Sau khi thu thập được gửi hoặc mang ngay về phòng thí nghiệm để giám định.
- Cần ghi rõ các thông tin của mẫu:
+ Ngày, địa điểm thu mẫu, tên của chủ ruộng lấy mẫu.
+ Cây trồng (giống, tuổi cây, lịch sử của cây, những cây trồng cùng) + Bộ phận cây bị hại
+ Đất đai (đất đỏ, đất đồi, đồng bằng, thung lũng…), quản lý (phân bón, thuốc trừ sâu bệnh, vệ sinh đồng ruộng…).
b. Phương pháp phân lập nấmPhytophthorapalmivora
Phương pháp phân lập Phytophthora từ bộ phận cây bệnh bằng sử dụng mồi bẫy (một số loại quả như: đu đủ, ca cao, táo, lê …thường phải xanh), [17].
- Phân lập từ đất cây bị bệnh quanh vùng rễ
+ Chọn đất ẩm trên bề mặt 5 cm của lớp đất dưới lớp rác lá, trong đó có rễ cây. + Đục những lỗ nhỏ bán kính 2 cm trên vỏ xanh quả ca cao hoặc các quả cây khác. + Trét đất ẩm vào các lỗ này.
+ Bọc quả trong túi nilon và đặt trong điều kiện phòng.
+ Kiểm tra quả hàng ngày nếu là Phytophthora thì phần thương tổn màu nâu lan rộng nhưng không thối nhũn.
+ Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn.
- Phân lập từ mô cây bệnh: cũng bẫy tương tự như từ đất bị bệnh. + Chọn mô nằm ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ.
+ Thanh trùng bề mặt bằng ethanol 70% hoặc HgCl2 (1%) khoảng 30 - 60 giây. Rửa sạch với nước cất và lau khô bằng giấy đã được khử trùng.
+ Cắt mô thành miếng nhỏ (< 5 mm).
+ Thanh trùng bề mặt quả trái cây, rạch quả và chèn mô bệnh đã thanh trùng vào. + Bọc quả mồi bẫy vào trong túi ni lon để trong nhiệt độ phòng.
+ Kiểm tra túi ủ hàng ngày, sau 2 - 3 ngày thấy vết thương tổn màu nâu lan rộng chứng tỏ có bị nhiễm Phytophthora.
+ Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn môi trường phân lập.
2.4.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo để xác định độc tính gây bệnh của nấm Phytophthora palmivora trên quả ca cao
Nguồn nấm thuần được nuôi cấy trên môi trường, tạo bào tử nang và du động bào tử bằng phương pháp cắt sợi, cạo bề mặt nấm. Cho nước cất vô trùng, để ở điều kiện 40C trong 2 giờ, sau đó để ở nhiệt độ phòng 24 giờ, kiểm tra mật độ bào tử. Lây dung dịch nấm với nồng độ 1% lên quả ca cao. Theo dõi tỷ lệ bệnh, thời gian tiềm dục của bệnh để xác định tác nhân gây bệnh và độc tính của chúng.
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học, sinh thái của nấm P. palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao
- Thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm hình thái: nấm Phytophthora được cấy trên môi trường PCA (potato carot agar) trong 7 ngày. Dùng dao mổ vô trùng cắt tản nấm thành các mảnh nhỏ (~ 1 cm). Các mảnh nhỏ được chuyển sang đĩa petri mới vô trùng. Kích thích nấm sinh bào tử bằng bổ sung 20 ml nước cất vô trùng vào mỗi đĩa, để ở điều kiện 40C trong 2 giờ, sau đó đặt trong tối ở điều kiện 25oC. Theo dõi sau 1 tuần khả năng hình thành bào tử. Hộp petri đã mọc bào tử, khêu lên lam kính và đo dưới kính hiển vi quang học:
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
+ Sợi nấm phồng,
+ Cách hình thành cành sinh bào tử, + Hình dạng bào tử,
+ Kích thước bào tử + Sự rụng của bào tử,
+ Đường kính lỗ giải phóng bào tử, + Sự hình thành, kích thước hậu bào tử.
- Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm P. palmivora:
Nhân nuôi nấm, sau đó cấy truyền nấm sang hộp petri có chứa các loại môi trường khác nhau: CA, PCA, PDA, CMA, Czapek, V8 Juice.
- Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng về nhiệt độ với nấm P. palmivora
- Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng khác nhau đến sinh trưởng phát triển của nấm P. palmivora:
Thí nghiệm bao gồm các công thức: tối liên tục, sáng liên tục, 12 giờ sáng xen kẽ 12 giờ tối liên tục.
- Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các độ pH khác nhau đến sinh trưởng của nấm P. palmivora: các ngưỡng pH làm thí nghiệm là 4,5; 5; 6; 7; 8.
Cách tiến hành: nấu môi trường CA (Ca rốt + agar) cho vào các bình tam giác ứng với các ngưỡng pH trên, hấp ở nhiệt độ 121oC, thời gian 20 phút. Sau khi hấp xong mang chuẩn bằng máy đo pH. Khi được các ngưỡng pH cần thí nghiệm đem đổ ra đĩa petri để cấy truyền nấm lên trên.
* Các chỉ tiêu chung cho 4 thí nghiệm trên
+ Môi trường nuôi cấy nấm: PCA, PDA. + Đặt điều kiện nhiệt độ: 25oC.
+ Mỗi công thức thí nghiệm làm 3 lần nhắc lại, mỗi lần 5 đĩa petri.
+ Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tốc độ phát triển của nấm ở các ngày thứ 2, 4, 6 sau khi cấy bằng cách đo đường kính tản nấm.
2.4.4. Phân lập và tuyển chọn một số vi sinh vật đối kháng nấm P. palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao trong điều kiện phòng thí nghiệm
a. Thu thập mẫu và phân lập các vi sinh vật đối kháng
- Thu thập mẫu: các mẫu rễ và đất vùng rễ được thu ở độ sâu 15 - 20cm xung quanh vùng rễ của cây không bị bệnh, sinh trưởng và phát triển tốt trong khu vực có sự hiển diện của bệnh do nấm Phytophthora gây nên. Mẫu được thu thập tại các vườn trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông.
- Phân lập nấm Trichoderma
Các mẫu rễ được rửa sạch qua vòi nước và khử trùng bề mặt bằng cồn 95o trong 30 giây sau đó rửa bằng cồn 75o trong 2 phút, cuối cùng rửa sạch lại 3 lần bằng nước cất khử trùng và cấy vào môi trường TME, CMA và PRBA.
nước cất khử trùng đến mức 100 ml, lắc 30 phút, lấy 10ml dung dịch chuyển sang tuýp chứa 90ml nước cất khử trùng, được dung dịch có nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành các bước như trên để có dung dịch với nồng độ pha loãng 10-3. Chuyển 0,5ml dung dịch có nồng độ 10-3 sang hộp petri có chứa môi trường TME, chan đều dung dịch và để các hộp Petri trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC. Kiểm tra sự sinh trưởng và phát triển của các VSV phân lập hàng ngày. Khi nấm sinh trưởng thì tách dòng thuần, tiến hành tách đơn bào tử chuyển sang môi trường dinh dưỡng phù hợp và bảo quản để thực hiện các thí nghiệm sau này.
- Phân lập vi khuẩn theo phương pháp nghiên cứu về vi khuẩn học của Wen- Chuan Chung và cs (2011) [58]. Mẫu đất đã được thu thập về hong khô trong mát khoảng 6 tiếng. Cân 1 gam đất cho mỗi lần lặp lại, mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần. Cho 1 gam đất vào bình tam giác hoặc ống tuýp lắc đều trên máy lắc trong 30 phút. Sau đó pha loãng mẫu ở các nồng độ và phân lập trên môi trường đặc hiệu cho từng loại vi sinh vật. Để trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC trong 4 - 7 ngày, theo dõi số khuẩn lạc sau phân lập. Tách thuần các chủng đã phân lập cấy truyền trên môi trường đặc hiệu.
Môi trường phân lập vi khuẩn: King B, PSA, NA Môi trường bảo quản vi khuẩn: Skim milk
b. Xác định khả năng đối kháng của các vi sinh vật có ích với nấm gây bệnh
- Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp.với nấm P. palmivora:
+ Môi trường thí nghiệm: PDA
+ Phương pháp tiến hành: cấy đối xứng hai bên + Chỉ tiêu theo dõi: đường kính ức chế của tản nấm
- Khả năng ức chế của nấm Trichoderma sp. đối với nấm P.palmivora bằng chất kháng sinh bay hơi: dựng 2 đĩa có đường kính bằng nhau, trên môi trường Czapek, một đĩa cấy nấm gây bệnh, một đĩa cấy nấm Trichoderma sp., úp 2 đĩa vào nhau và giữ kín hộp đĩa. Đối chứng là cặp Petri cấy nấm gây bệnh. Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của từng loại nấm và khả năng ức chế nấm gây bệnh bởi chất kháng sinh bay hơi do nấm Trichoderma sinh ra.
- Hoạt tính đối kháng của vi khuẩn có ích với nấm P. palmivora được đánh giá theo phương pháp của Wen-Chuan Chung và cs (2011) [58]. Nấm Phytophthora đã được cấy thuần, sử dụng đục lỗ đục trên mặt thạch, cấy miếng nấm vào giữa hộp đĩa Petri. Sau đó dùng que cấy khuẩn vạch 2 đường đối xứng, dài khoảng 3 cm hai bên nấm Phytophthora
đã cấy. Theo dõi sự phát triển của nấm bệnh Phytophthora, đo đường kính tản nấm sau cấy từ 4 ngày đến 10 ngày. Mỗi công thức tiến hành 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 5 đĩa.
2.4.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và sinh hóa của một số nấm Trichoderma sp. có khả năng đối kháng cao với nấm P. palmivora
2.4.5.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, nhiệt độ đến sự phát sinh, phát triển của nấm Trichoderma sp.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy: nấm được cấy trên một số môi trường thích hợp với nấm đối kháng PDA, CMA, Czapek. Sau đó được đặt ở điều kiện nhiệt độ: 25oC. Theo dõi đường kính sợi nấm sau 2; 3; 5 ngày nuôi cấy, thời gian xuất hiện bào tử nấm và đếm số lượng bào tử nấm/ ml.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của độ pH: nấm được cấy trên môi trường PDA, với các ngưỡng pH: 4; 5; 6; 7. Cách tiến hành: nấu môi trường PDA cho vào các bình tam giác ứng với các ngưỡng pH trên, hấp ở nhiệt độ 121oC, thời gian 20 phút. Sau khi hấp xong mang chuẩn bằng máy đo pH. Khi được các ngưỡng pH cần thí nghiệm đem đổ ra đĩa petri để cấy truyền nấm lên trên. Theo dõi đường kính sợi nấm sau 1; 2; 3 ngày nuôi cấy, thời gian xuất hiện bào tử nấm và đếm số lượng bào tử nấm/ ml.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ: nấm được cấy trên môi trường PDA có độ pH thích hợp đã được xác định và đặt ở nhiệt độ: 15; 20; 25; 30; 35; 400C. Theo dõi đường kính sợi nấm sau 2; 4; 6 ngày nuôi cấy, thời gian xuất hiện bào tử nấm và đếm số lượng bào tử nấm/ ml.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng: nấm được cấy trên môi trường PDA, được tiến hành với 3 điều kiện chiếu sáng: tối liên tục, sáng liên tục, 12 giờ sáng xen kẽ 12 giờ tối liên tục. Theo dõi đường kính sợi nấm sau 1; 2; 3 ngày nuôi cấy, thời gian xuất hiện bào tử nấm và đếm số lượng bào tử nấm/ ml.
2.4.5.2. Phương pháp định tính hoạt độ enzyme chitinase, β-glucanase và cellulase của nấm Trichoderma
Hoạt độ các enzyme chitanase, ß-glucanase và cellulase của nấm
Trichoderma được định tính bằng phương pháp đo đường kính vòng phân giải trên môi trường cảm ứng tổng hợp của từng loại enzyme [58].
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase và β - glucanase:
Urê 0,3g (NH4)2SO4 1,4g MgSO4.7H2O 0,3g CaCl2.6H2O 0,3g Glucose 0,5g β- Glucan 2g
hoặc huyền phù chitin 10g Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+ 0,1% (v/v)
Nước cất 1lít
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme cellulase:
K2HPO4 2 g
(NH4)2SO4 2g
NaCl 2 g
MgSO4. 7H2O 2 g
Agar 15g
CMC (cacboxyl methyl cellulose) 10g
(Tinh bột tan 0,2% đối với thí nghiệm phân giải tinh bột)
Nước cất 1lít
pH 7,0- 7,2.
- Phương pháp tiến hành: đổ môi trường vào đĩa Petri, cấy nấm Trichorderma
trên môi trường (phương pháp thỏi thạch), đặt ở nhiệt độ thích hợp, quan sát vòng phân giải cellulase được tạo ra quanh vết cấy bằng dung dịch thuốc thử Lugol.
* Bảo quản và lưu giữ các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với tác nhân gây bệnh.
- Phương pháp 1: Lưu giữ nguồn trên giấy, nấm được giữ trên các mẩu giấy vô trùng, hút chân không trong 14 ngày sau đó bảo quản trong tủ lạnh sâu – 20oC.