5. Điểm mới của đề tài
3.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến quá trình lên men vang nho
3.2.1. Ảnh hưởng của nitơ hữu cơ
Có rất nhiều nguồn nitơ khác nhau đƣợc sử dụng trong nuôi cấy nấm men. Các nguồn nitơ hữu cơ thƣờng là hỗn hợp các axit amin (nấm men chỉ sử dụng đƣợc axit amin ở dạng tự nhiên), các peptit, các nucleotit,... Trong thực tế ngƣời ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tƣơng, khô lạc,...) làm nguồn nitơ hữu cơ. Tuy nhiên chúng ta thấy rằng pepton là nguồn nitơ hữu cơ đƣợc sử dụng chủ yếu bởi pepton là nguồn nitơ thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men cộng với giá thành thấp thích hợp cho quá trình sản xuất.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm để xác định nguồn nitơ hữu cơ nào phù hợp với sự phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M3 trong môi trƣờng lên men có HL đƣờng 250g/l, pH: 4, HL men giống 10%, pepton ở các HL từ 1 – 10g/l, TG 6 – 7 ngày. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.6.
30
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của các HL pepton tới quá trình lên men của chủng nấm men S.cerevisiae M3 HL (g/l) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 SLTB (x106) 170 230 420 490 340 310 230 160 140 110 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hàm lượng pepton (g/l) Hàm lượng pepton
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hƣởng của các HL pepton tới quá trình lên men của chủng nấm men S.cerevisiae M3
Từ bảng số liệu và biểu đồ ta thấy rằng nguồn nitơ hữu cơ từ pepton ở HL 3 – 4 g/l các tế bào nấm men sinh trƣởng, phát triển tốt, SLTB tạo ra nhiều 420 – 490×106
tế bào. Ở HL pepton 1 – 2g/l SLTB nấm men thấp 170 – 230×106 tế bào. Khi HL nitơ trong dịch lên men thấp, có thể dẫn tới sinh trƣởng của nấm men chậm, kéo dài TG lên men hoặc lên men không triệt để, giảm năng suất. Thêm vào đó, số lƣợng các sản phẩm chuyển hóa có thể làm
SLTB × 106
31
giảm chất lƣợng do acid amin và các peptide tạo thành H2S, các este không bình thƣờng và thay đổi sự tạo thành diacetyl. HL pepton 5 – 10g/l ta thấy SLTB nấm men giảm dần từ 340×106 xuống còn 110×106 tế bào. Ở HL pepton cao SLTB nấm men sinh trƣởng, phát triển chậm do môi trƣờng quá giàu chất dinh dƣỡng. Kết quả nghiên cứu này là phù hợp với một số tác giả trƣớc Vũ Thu Hồng [7].
Vì vậy tôi thấy rằng nguồn nitơ hữu cơ từ pepton ở HL pepton 3 – 4 g/l là thích hợp để bổ sung vào quá trình lên men.
3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ
3.2.2.1. Xác định nguồn nitơ vô cơ phù hợp với sự sinh trưởng, phát triển chủng nấm men S.cerevisiae M3
Nguồn nitơ vô cơ cũng có ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng, phát triển của tế bào nấm men. Để xác định nguồn nitơ vô cơ nào là phù hợp của chủng nấm men S.cerevisiae M3 chúng tôi tiến hành thí nghiêm trong môi nhân giống với các nguồn nitơ khác nhau là (NH4)2SO4, KNO3, KNO2 nồng độ 0,2%. HL men giống 10%, nuôi cấy trên may lắc trong TG 4 – 5 ngày với tốc độ 150 vòng/phút. Sau đó chúng tôi tiến hành đếm SLTB nấm men trên 1ml dịch lên men để xác định sự phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M3. Kết quả đếm đƣợc dẫn ra ở bảng 3.7.
32
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của các nguồn nitơ vô cơ tới sự phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M3 TG (h) SLTB nấm men S.cerevisiae M3 (×106 tế bào/ml) (NH4)2SO4 KNO3 KNO2 0 4 ± 0.00 4 ± 0.00 4 ± 0.00 12 18 ± 0.2 8 ± 0.4 8 ± 0.2 24 24 ± 0.3 13 ± 0.2 11 ± 0.3 36 86 ± 0.3 67 ± 0.2 58 ± 0.2 48 112 ± 0.4 83 ± 0.4 77 ± 0.4 60 145 ± 0.2 106 ± 0.2 97 ± 0.4 72 149 ± 0.3 110± 0.3 102 ± 0.2 84 143 ± 0.1 105 ± 0.2 98 ± 0.2 96 129 ± 0.3 98 ± 0.3 87 ± 0.4 108 92 ± 0.4 79 ± 0.1 73 ± 0.4 0 20 40 60 80 100 120 140 160 12 24 36 48 60 72 84 96 108 Thời gian (h) S ố lư ợn g tế b ào (NH4)2SO4 KNO3 KNO2
Hình 3.6. Đồ thì biểu diễn động thái phát triển của chủng nấm men
33
Từ bảng số liệu 3.7 và vào đồ thị hình 3.6 ta thấy chủng nấm men
S.cerevisiae M3 phát triển tốt trên môi trƣờng dinh dƣỡng chứa (NH4)2SO4. Từ 2 – 4 ngày đầu chúng sinh sản và phát triển nhanh nhất đạt 149×106
tế bào (pha sinh trƣởng), duy trì ổn định ở ngày thứ 4 – 5 (pha cân bằng). Sau đó giảm dần vào các ngày sau. Tiếp sau đó là môi trƣờng dinh dƣỡng chứa KNO3 sau 72 h nuôi cấy SLTB lớn nhất là 123×106 tế bào rồi đến môi trƣờng chứa KNO2 là 115×106 tế bào (72h).
Tuy nhiên trong thực tế sản xuất thì chỉ có nguồn (NH4)2SO4 là đƣợc sử dụng làm nguồn cung cấp nitơ cho quá trình sinh trƣởng, phát triển của nấm men. Do nguồn nitơ ở dạng NH4+ gần với tiền chất của nitơ hữu cơ, là nguồn cung cấp nitơ rất dễ cho nấm men sử dụng. Còn KNO3 và KNO2 không đƣợc sử dụng vì chúng chứa gốc nitrat gây độc có thể gây bệnh ung thƣ cho con ngƣời [11].
Vì vậy tôi thấy rằng nguồn nitơ vô cơ thích hợp để cung cấp cho quá trình lên men của chủng nấm men S.cerevisiae M3 là (NH4)2SO4.
3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các hàm lượng (NH4)2SO4 sự sinh trưởng, phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M3
Nghiên cứu tiếp theo với (NH4)2SO4, mục đích xác định nồng độ (NH4)2SO4 phù hợp nhất đối với sự phát triển của chủng nấm men
S.cerevisiae M3 chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu trong môi trƣờng lên men, HL đƣờng 250g/l, pH: 4, HL men giống 10%, (NH4)2SO4 ở các nồng độ 0.1‰, 0.2‰, 0.3‰, 0.4‰, 0.5‰, với TG lên men là 7 – 9 ngày. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra ở bảng 3.8.
34
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 phù hợp nhất đối với sự phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M3
Chỉ tiêu đánh giá Nồng độ (NH4)2SO4 (‰) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Lƣợng đƣờng sót (g/l) 3.5 ± 0.1 2.4 ± 0.2 2.6 ± 0.1 2.9 ± 0.2 3.6 ± 0.1 Độ cồn (%V) 8.7 ± 0.1 9.8 ± 0.2 9.6 ± 0.2 8.5 ± 0.1 8.3 ± 0.2 pH 3.6 ± 0.1 3.9 ± 0.2 4.0 ± 0.1 3.4 ± 0.2 3.1 ± 0.3 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 H àm l ư ợ n g đ ư ờ n g sót ( g/ l) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn HL đƣờng sót trong dịch lên men ở các nồng độ (NH4)2SO4 khác nhau
35 8,7 9,8 9,6 8,5 8,3 7,5 8 8,5 9 9,5 10 H àm lượ ng c ồn %V 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn HL cồn trong dịch lên men ở các nồng độ (NH4)2SO4 khác nhau 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 N ồ n g đ ộ p H 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH trong dịch lên men ở các nồng độ (NH4)2SO4 khác nhau
Từ kết quả ở bảng 3.8 và các biểu đồ chúng tôi thấy rằng nồng độ (NH4)2SO4 trong khoảng 0.2‰ – 0.3‰ thích hợp cho quá trình lên men. Vì ở
Nồng độ (NH4)SO4 ‰
36
nồng độ này dịch lên men có HL đƣờng sót thấp từ 2.4 – 2.6g/l, HL cồn ở mức 9.8 – 9.6%V.
Bên cạnh đó chúng ta thấy rằng nồng độ (NH4)2SO4 trong dịch lên men tăng thì HL đƣờng sót cũng tăng, trong khi đó độ cồn đạt đƣợc giảm do pH của dung dịch thay đổi làm rối loạn quá trình TĐC của tế bào nấm men. Nếu quá ít sẽ làm tốc độ lên men yếu, HL đƣờng sót cũng tăng, HL cồn giảm. Kết quả nghiên cứu phù hợp với các tác giả trƣớc đó [10], [6].
Vì vậy chúng tôi quyết định chọn nguồn nitơ vô cơ từ (NH4)2SO4 với HL 0.2‰ – 0.3‰ để bổ sung vào dịch lên men.
3.3. Lên men vang nho và xây dựng quy trình lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm phòng thí nghiệm
3.3.1. Lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm
Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi tiến hành lên men vang nho với môi trƣờng lên men là môi trƣờng 3 (MT3) ở điều kiện 280
C, pH: 4 tỉ lệ men giống là 10% với quy mô phòng thí nghiệm trong các bình lên men 5 lít, sau khi kết thúc giai đoạn lên men chính khoảng 9 ngày. Chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ số cần thiết và chuyển sang giai đoạn lên men phụ. Kết quả phân tích đƣợc dẫn ra bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả phân tích rƣợu thành phẩm
Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Mẫu
Độ rƣợu % V 9.87
Đƣờng sót % 2.8
Acid % 0.42
Độ pH 4.2
Sản phẩm đƣợc đánh giá cao. Trên cơ sở đó chúng tôi xây dựng quy trình lên men vang nho.
37
3.3.2. Xây dựng quy trình công nghệ lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm nghiệm
3.3.2.1. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất vang nho
Giống Giống 1 Giống cấp 2 Lọc Đóng chai Tàng trữ Rửa sạch, bổ sung đƣờng Quả nho chín
Môi trƣờng lên men Dịch quả
Lên men chính (7 – 9 ngày)
Vang non
Lên men phụ
Lọc Môi trƣờng nhân giống
38
3.3.2.2. Thuyết minh công nghệ
Quy trình sản xuất vang nho gồm 4 giai đoạn chính Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men
Giai đoạn 2: Lên men chính
Giai đoạn 3: Lên men phụ (ủ chín vang)
Giai đoạn 4: Hoàn thiện chất lƣợng và tiêu thụ sản phẩm
Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men
Quả nho chín đƣợc thu hoạch từ các vƣờn trồng nho về chọn ra những quả lành, không sâu bênh, loại bỏ những quả dập nát, quả thối. Sau đó rửa lại bằng nƣớc cho sạch bụi bẩn rồi để ráo nƣớc. Nho đƣợc đƣa vào các thùng ngâm đƣờng với tỉ lệ 1:1. Sau khoảng 15 ngày ta thu đƣợc dịch siro hoa quả có nồng độ đƣờng khoảng 60 – 80% và nhiều chất dinh dƣỡng khác đƣợc chiết từ thịt quả.
Giai đoạn 2: Lên men chính
Dịch lên men đƣợc bổ sung nấm men (tỉ lệ khoảng 7 – 10%). Điều chỉnh nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men thƣờng khoảng 25 – 300
C. Trong quá trình lên men phải tiến hành phân tích mẫu và kiểm tra nấm men thƣờng xuyên để điều chỉnh quá trình lên men cho phù hợp và để hạn chế sự thất thoát cồn, hƣơng thơm, mùi vị,… trong quá trình lên men chính cần thiết phải lên men đầy bình, nên giữ áp lực ở mức thấp. Lên men chính thƣờng kết thúc sau khoảng 7 – 9 ngày.
Giai đoạn 3: Lên men phụ (ủ chín vang)
Quá trình lên men phụ hay còn gọi là ủ vang nên giữ ở nhiệt độ < 100 C, sau khi kết thúc lên men đƣợc 80 – 90 ngày có thể tiến hành tách cặn ở đáy bình sau đó có thể bổ sung phụ gia lắng trong bằng cách pha loãng chất phụ gia với cồn (10 – 15%V) và cho từ từ vào bình, vừa cho vừa khuấy theo một
39
chiều cố định trong khoảng 10 – 15 phút. Trong TG tàng trữ ngƣời ta thƣờng tách cặn ở đáy bình 2 – 3 lần trong suốt TG tàng trữ.
Giai đoạn 4: Hoàn thiện chất lượng và tiêu thụ sản phẩm
Sau khi ủ chín vang để tăng cƣờng giá trị cảm quan, độ trong của sản phẩm thì cần phải tiến hành lọc vang đến khi sản phẩm đạt đến độ trong cần thiết. Việc đóng chai và tiêu thụ sản phẩm thƣờng đƣợc tiến hành ngay sau khi lọc vang lần cuối. Để tránh gây ô nhiễm rƣợu khi đóng chai cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các yêu cầu vệ sinh ở giai đoạn này. Vang sau khi đóng chai có thể đƣợc cất trữ và bảo quản trong TG dài.
40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Kết quả nghiên cứu, tôi đã phân lập, tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả năng sinh trƣởng, phát triển tốt, hoạt lực lên men cao, HL đƣờng sót trong dich lên men thấp, độ cồn cao, tạo vang có hƣơng vị thơm ngon, độ lắng cao.
Căn cứ vào khóa phân loại của Lodder (1970) chúng tôi xác đinh đƣợc tên của chủng nấm men đƣợc tuyển chọn là S.cerevisiae M3.
1.2. Chúng tôi đã nghiên cứu tìm hiểu ảnh hƣởng của nồng độ nitơ đến lên men rƣợu vang. Trong đó nguồn nitơ hữu cơ từ pepton 3-4 g/l và nguồn nitơ vô cơ từ (NH4)2SO4 với HL 0.2‰ – 0.3‰ là thích hợp để bổ xung vào quá trình lên men rƣợu vang nho.
1.3. Lên men thành công vang nho tạo ra đƣơc một loại vang có chất lƣợng tốt và xây dựng đƣợc quy trình lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm.
2. Kiến nghị
Từ kết quả thu đƣợc, chúng tôi mong muốn chủng nấm men đã đƣợc tuyển chọn ở trên cần đƣợc áp dụng vào sản xuất vang nho, nhằm sử dụng nguồn nguyên liệu có sẵn trong nƣớc từ các vùng trồng nho nhƣ: Bình Thuận, Ninh Thuận. Qua việc sản xuất rƣợu vang nho này cũng sẽ góp phần làm phong phú thị trƣờng vang trong và ngoài nƣớc.
41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Nguyễn Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2011). Hóa sinh hoc. Nxb Giáo dục (pp 156 – 161)
[2]. Nguyễn Lân Dũng và cộng tác viên (1976). Một số phƣơng pháp nghiên cứu VSV tập II, III. Nxb Khoa học kỹ thuật
[3]. Nguyễn Thành Đạt (1979). Vi sinh học đại cƣơng. Nxb Giáo dục
[4]. Nguyễn Thành Đạt (2000). Cơ sở Vi sinh học. Nxb Giáo dục, tập 1 và 2
[5]. Nguyễn Thị Hào (2010). Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo, Khóa luận tốt nghiệp trường ĐHSP Hà Nôi 2
[6]. Vũ Công Hậu (1982). Chế vang trái cây trong gia đình, Nxb Nông nghiệp
[7]. Vũ Thu Hồng (2012). Nghiên cứu ảnh hưởng của nitơ tới quá trình lên men rượu vang,Khóa luận tốt nghiệp Đai học Sư phạm Hà Nội 2
[8]. Đinh Thị Kim Nhung. Giáo trình – VSV. Nxb ĐHSP Hà Nội 2 (pp 177 – 189)
[9]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Phƣơng Châm, Đặng Thị Thu Hiền (1998). Tuyển chọn chủng nấm men dùng cho lên men rượu vang. Thông báo khoa học trường ĐHSP Hà Nội 2, số 1
[10]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh (2011). Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của chủng S.cerevisiae H2 và H8, Thông báo khoa học, trường ĐHSP Hà Nội 2, số 1
(pp 300 – 310)
[11]. Lƣơng Đức Phẩm (2004). Công nghệ VSV. Nxb Nông nghiệp HN (pp 237 – 243)
[12]. Đinh Thị Kim Phƣơng (1993). Nghiên cứu và lựa chọn chủng nấm men phù hợp với yêu cầu sản xuất rượu vang. Luận án Thạc sĩ sinh học
42
[13]. Lê Xuân Phƣơng (2011). VSV học công nghiệp. Nxb Giáo dục
[14]. Nguyễn Đình Sinh (1997). Nấm men và khả năng sử dụng chúng trong công nghệ sinh học. Luận án Tiến sĩ trường ĐHSP Hà Nội
[15]. Mark Berkowitz (September/October năm 1996). “World's Earliest Wine”, Archaeology (Archaeological Institute of America) 49 (5), truy cập ngày 13 tháng 1 năm 2011
[16]. “Oldest known wine-making facility' found in Armenia”. BBC News (BBC), 11 tháng 1 năm 2011, truy cập ngày 13 tháng 1 năm 2011