5. Điểm mới của đề tài
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp tuyển chọn khuẩn lạc nấm men trên môi trường thạch đĩa
Để chọn một tập hợp tế bào nấm men ta sử dụng phƣơng pháp phân lập trên hộp petri. Môi trƣờng để tuyển chọn các lạc khuẩn nấm men là môi trƣờng Hansen (MT1) [5].
2.4.2. Phương pháp hoạt hóa giống
Trƣớc khi đƣa và lên men để có những tế bào to khỏe ta tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi trên môi trƣờng thạch nghiêng 28 – 300
19
Sau đó cấy vào dịch nhân giống trong 24h đƣợc giống cấp 2. Dùng giống cấp 2 để lên men [2].
2.4.3. Phương pháp xác định hoạt lực lực lên men của nấm men
Để xác định hoạt lực lên men của nấm men so sánh giữa các chủng ta dùng các phƣơng pháp sau:
Phƣơng pháp cân trọng lƣợng bình: Dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 môi trƣờng, cùng có một lƣợng trung bình nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng khi chênh lệch giữa 2 lần là 0,1 thì dừng lại [6].
Phƣơng pháp xác định SLTB bằng buồng đếm Goriaev [2].
2.4.4. Phương pháp quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi
Tế bào nấm men đƣợc nhuộm đơn bằng cách: Lấy một lƣợng nhỏ tế bào từ ống thạch nghiêng, dàn đều lên lam kính có chứa 1 giọt nƣớc cất rồi cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó nhỏ 1 – 2 giọt xanh metylen lên vết bôi, để trong 2 – 3 phút rồi rửa bằng nƣớc cất. Làm khô tiêu bản rồi quan sát trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần [10], [12].
2.4.5. Phương pháp phân tích
Xác định HL đƣờng bằng khúc xạ kế.
Xác định độ cồn bằng ancol kế và phƣơng pháp hóa học. Xác định độ pH bằng giấy đo pH.
Xác định HL axit trong dung dịch lên men bằng cách dựa vào nguyên tắc trung hòa axit bằng dung dịch NaOH 0,1N. Từ số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ ta xác định đƣợc HL axit có trong dung dịch [10].
2.4.6. Phương pháp xác định khả năng kết lắng
Khả năng kết lắng của nấm men đƣợc xác định dựa trên tốc độ lắng của sinh khối, cách tiến hành nhƣ sau: Hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (pH: 4.5) trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thƣớc bằng nhau
20
với thể tích của dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hoàn toàn bằng nhau. Sau đó đen lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong TG 3 – 5 phút, để lắng 15 phút. Khối dịch chia thành 2 lớp bằng, phần đáy là nấm men. Tiến hành đo lớp kết lắng của chủng nấm men trong các ống nghiệm. Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất tức là có độ kết lắng tốt nhất [2].
2.4.7. Phương pháp cảm quan
Sử dụng các giác quan đánh giá về giá trị cảm quan khác nhau (màu sắc, độ trong, mùi vị,…). Số ngƣời tham gia cảm quan đƣợc tính theo thang điểm 20, giá trị cảm quan là giá trị trung bình cộng của các đánh giá riêng lẻ [5].
2.4.8. Phương pháp xử lý kết quả bằng thống kê toán học
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp nhƣ:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: 1 1 n i i X X n
Trung bình bình phƣơng các sai lệch:
1 ) ( 1 2 n X X n i i
Sai số đại diện của trung bình cộng: M = S n Hệ số biến thiên: Cv = S X x 100%
21 Trong đó: n: Số lần nhắc lại Xi: Giá trị của lần thứ i S: Độ lệch chuẩn m: Sai số trung bình học 2.5. Phạm vi nghiên cứu
Chủng nấm men S.cerevisiae phân lập đƣợc từ dịch nho.
2.6. Địa điểm thực hiện đề tài
Phòng thí nghiệm VSV, khoa Sinh – KTNN, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2
22
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men S.cerevisiae
Những chỉ tiêu định hƣớng lựa chọn chủng nấm men: Nấm men đóng vai trò quan trọng đối với toàn bộ quy trình sản xuất và chất lƣợng vang. Bên cạch những chỉ tiêu hình dạng, kích thƣớc khuẩn lạc, độ nhẵn bóng còn phải chú ý đến các chỉ tiêu sau:
Chịu đƣợc độ cồn và độ axit cao.
Có khả năng lên men tốt trong môi trƣờng có HL đƣờng cao. Có hiệu suất lên men cao.
Tốc độ phát triển nhanh, chu kì lên men ngắn. Tạo đƣợc hƣơng thơm và vị đặc trƣng.
Dễ lắng trong và dễ lọc.
3.1.1. Phân lập chủng nấm men S.cerevisiae từ dịch nho
Trong quả đã có những giống nấm men có sẵn, các giống này có khả năng chịu đƣợc những điều kiện khác nhau nhƣ HL đƣờng cao, độ axit cao,… Chọn những quả nho to, đồng đều, không bị dập nát, không bị thối hỏng, đƣợc rửa sạch, để ráo nƣớc, sau đó đem ngâm đƣờng theo tỉ lệ 1:1. Sau khoảng 15 ngày thì vớt xác quả ra và lọc lấy dịch quả. Sau đó tiến hành phân lập trên môi trƣờng vô trùng môi trƣờng phân lập ở đây là môi trƣờng Hansen.
Cách tiến hành: Phân lập trên môi trƣờng thạch đĩa đã vô trùng, chuẩn bị 10 ống nghiệm định mức, dùng pipet hút 9ml nƣớc cất vào mỗi ống. Lấy 1ml dịch quả cho vào ống thứ nhất (dịch pha loãng ở 10-1). Sau đó lại hút 1ml dịch ở ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 đƣợc dung dịch có độ pha loãng 10-2
23
tƣơng tự với các ống tiếp theo cho đến ống 9 sẽ có độ pha loãng 10-9. Có thể chọn ở các nồng độ 10-6
– 10-9.
Phân lập: Dùng pipet hút 1 – 2 giọt dịch pha loãng nhỏ vào đĩa Petri có sẵn môi trƣờng Hansen đã đƣợc khử trùng. Sau đó dùng que trang dàn đều lên mặt thạch. Đặt ngƣợc các hộp Petri xuống, dùng giấy báo gọi lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 25 – 300
C. Sau 2 – 3 ngày lấy ra quan sát. Trên bề mặt thạch ta thấy xuất hiện những khuẩn lạc, dựa vào hình thái khuẩn lạc nấm men ta chọn những khuẩn lạc to, tròn, lồi, nhẵn bóng có màu trắng đục đặc trƣng cho nấm men. Kết quả phân lập chọn đƣợc ra 3 mẫu nấm men dùng làm đối tƣợng nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.1. Chủng nấm men phân lập đƣợc trên môi trƣờng thạch đĩa
Sau đó các khuẩn lạc này chúng tôi cấy sang các ống thạch nghiêng đã có sẵn môi trƣờng Hansen vô trùng để giữ giống, sau 2 – 3 ngày lấy ống thạch nghiêng ra quan sát, làm tiêu bản soi kính để kiểm tra hình thái tế bào nấm men. Kí hiệu cho các chủng nấm men thu đƣợc là M1, M2, M3.
24
Hình 3.2. Cấy truyền chủng nấm men M1, M2, M3 trên môi trƣờng thạch nghiêng
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho
3.1.2.1. Xác định hoạt lực lên men của các chủng nấm men bằng HL CO2
thoát ra
Quá trình lên men của 3 chủng nấm men đƣợc biểu thị bằng HL CO2 sinh ra. Lƣợng CO2 sinh ra và thoát ra môi trƣờng càng nhiều thì trọng lƣợng bình càng giảm. Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu bằng cách cho các chủng vào môi trƣờng dịch quả 100ml có HL đƣờng 250g/l, pH: 4, số lƣợng giống ban đầu 3,5 x 106, nhiệt độ 25 – 280C. Sau 72h mở nắp bình lên men đem cân trọng lƣợng bình ta thấy trọng lƣợng bình giảm đó chính là lƣợng CO2 thoát ra. Kết quả đƣợc dẫn ra bảng 3.2.
25
Bảng 3.2. Hoạt lực lên men của các chủng nấm men (g/100ml) sau 5 ngày
Tên chủng nấm men
Trọng lƣợng bình ban đầu (g)
Trọng lƣợng bình sau 5 ngày lên
men (g) Lƣợng CO2 thoát ra (g) M1 155.5 ± 0.02 152.6 ± 0.02 2.9 ± 0.02 M2 156.92 ± 0.03 154.68 ± 0.03 2.24 ± 0.03 M3 158.84 ± 0.02 155.64 ± 0.02 3.2 ± 0.02
Từ kết quả của bảng trên, chúng tôi thấy rằng chủng M3 có HL CO2 thoát ra nhiều hơn chứng tỏ hoạt lực lên men mạnh nhất. Tiếp đó là các chủng M1 và M2.
3.1.2.2. Nghiên cứu khả năng lên men các loại đường
Xác định khả năng lên men đƣờng của các chủng nấm men thu đƣợc chúng tôi tiến hành xác định HL đƣờng sót và nồng độ cồn trong dịch lên men. Các chủng nấm men đƣợc đƣa vào môi trƣờng dịch quả 100ml, HL đƣờng 250g/l, pH: 4, nhiệt đô 25 – 280C, số lƣợng giống ban đầu 3,5 x 106
tế bào/ml. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.3.
Từ kết quả ở bảng, chúng tôi thấy chủng M3 lên men có HL cồn và hiệu suất lên men cao nhất, sau đó là các chủng M1 và M2.
26
Bảng 3.3. Khả năng lên men của các chủng nấm men ở các loại đƣờng khác nhau
Chỉ tiêu đánh giá Chủng nấm men
M1 M2 M3
Đƣờng tổng số (g) 250 ± 0.52 250 ± 0.2 250 ± 0.2 HL đƣờng sót (%) 3.8 ± 0.01 4.2 ± 0.01 2.6 ± 0.02
HL cồn (%V) 9.8 ± 0.05 8.7 ± 0.02 10.5 ± 0.05
3.1.2.3. Khả năng kết lắng của các chủng nấm men
Tiến hành hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong TG 3 – 5 phút. Chúng tôi thu đƣợc kết quả bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của các chủng nấm men
Tên chủng M1 M2 M3
Chiều cao cột sinh khối (mm) 17,5 17,9 18,2
Từ kết quả ở bảng trên, chúng tôi thấy rằng mẫu có khả năng tốt kết lắng tốt nhất là chủng M3 sau đó là các chủng M1 và M2.
3.1.2.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới quá trình lên men
Trong quá trình lên men rƣợu vang pH luôn luôn thay đổi đã ảnh hƣởng tới quá trình lên men. Để tìm ra pH ban đầu thích hợp cho lên men. Chúng tôi tiến hành thí nghiêm lên men trong môi trƣờng dich nho có HL đƣờng 250g/l, nhiệt độ 25 – 280C, số lƣợng giống ban đầu 3,5 x 106
KH2PO4 0.8% ở pH biến đổi khác nhau (pH: 3; 3.5; 4; 4.5; 5; 5.5). pH đƣợc điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 0.1N, dung dịch axit axetic 98% và đo độ pH bằng giấy đo pH. Xác
27
định lƣợng CO2 thoát ra sau 24h nuôi cấy, kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau
Chủng pH 3 3.5 4 4.5 5 M1 + + +++ +++ + M2 + + ++ +++ + M3 + ++ ++ +++ + Trong đó:
+++: HL CO2 đƣợc tạo ra trên 30g/l dịch lên men
++ : HL CO2 đƣợc tạo ra từ 25 – 30g/l dịch lên men
+ : HL CO2 đƣợc tạo ra trên 20 g/l dịch lên men
Từ kết quả thu đƣơc chúng tôi thấy rằng chủng M3 có khả năng lên men mạnh ở môi trƣờng có pH cao (pH: 4.5), cụ thể là sau 24h nuôi cấy HL CO2 đƣợc tạo ra lớn > 30g/l dịch lên men. Ở pH: 3 – 4 HL CO2 đƣợc tạo ra thấp dƣới 30g/l dịch lên men, là do ở độ pH thấp môi trƣờng axit ức chế quá trình sinh trƣởng của tế bào nấm men. Ở pH > 5 HL CO2 đƣợc tạo ra cũng thấp < 20 g/l các tế bào nấm men phát triển chậm môi trƣờng dịch lên men thuận lợi cho nấm mốc phát triển ảnh hƣởng đến chất lƣợng rƣợu. Nhƣng thực tế pH: 4 – 4.5 là phù hợp với pH dịch quả do đó chủng M3 vẫn là chủng có khả năng lên men tốt nhất.
3.1.2.5. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của sản phẩm
Sau khi lên men đƣợc 30 ngày, chúng tôi tiến hành xác định khả năng tạo hƣơng thơm, độ trong bằng phƣơng pháp cảm quan. Từ kết quả cho thấy chủng nấm men M3 đạt độ trong và hƣơng thơm tốt hơn 2 chủng còn lại.
28
Tổng hợp các kết quả từ các thí nghiệm trên cho thấy chủng nấm men M3 có khả năng lên men tốt nhất và tạo sản phẩm có nhiều ƣu điểm. Vì vậy chúng tôi chọn chủng M3 để tiếp tục nghiên cứu.
3.1.2.6. Xác định tên khoa học của chủng nấm men nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành xác định tên khoa học của chủng nấm men ở mẫu M3 chúng tôi dựa vào đặc tính sinh học của nấm men nhƣ:
Khả năng lên men các loại đƣờng. Khả năng đồng hóa các muối nitrat.
Khả năng hình thành bào tử kết hợp quan sát khuẩn lạc. Quan sát hình dạng tết bào trên kính hiển vi.
Sinh sản nảy chồi từ nhiều phía.
Căn cứ vào khóa phân loại của Lodder (1970) và các kết quả thí nghiệm đối với chủng nấm men M3 có đặc tính:
1. Sinh sản nảy chồi nhiều phía.
2. Tế bào hình trứng, ovan, hình cầu (hình 3.1).
29
Hình 3.4. Ảnh chụp tế bào chủng nấm men M3 độ phóng đại 1000 lần
Từ đó, căn cứ vào khóa phân loại của Lodder (1970) và các kết quả thí nghiệm đối với chủng nấm men M3 chúng tôi xác định tên khoa học của chủng nấm men M3 phân lập từ dịch quả nho là S.cerevisiae M3 (S.cerevisiae
M3).
3.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến quá trình lên men vang nho
3.2.1. Ảnh hưởng của nitơ hữu cơ
Có rất nhiều nguồn nitơ khác nhau đƣợc sử dụng trong nuôi cấy nấm men. Các nguồn nitơ hữu cơ thƣờng là hỗn hợp các axit amin (nấm men chỉ sử dụng đƣợc axit amin ở dạng tự nhiên), các peptit, các nucleotit,... Trong thực tế ngƣời ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tƣơng, khô lạc,...) làm nguồn nitơ hữu cơ. Tuy nhiên chúng ta thấy rằng pepton là nguồn nitơ hữu cơ đƣợc sử dụng chủ yếu bởi pepton là nguồn nitơ thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men cộng với giá thành thấp thích hợp cho quá trình sản xuất.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm để xác định nguồn nitơ hữu cơ nào phù hợp với sự phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M3 trong môi trƣờng lên men có HL đƣờng 250g/l, pH: 4, HL men giống 10%, pepton ở các HL từ 1 – 10g/l, TG 6 – 7 ngày. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.6.
30
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của các HL pepton tới quá trình lên men của chủng nấm men S.cerevisiae M3 HL (g/l) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 SLTB (x106) 170 230 420 490 340 310 230 160 140 110 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hàm lượng pepton (g/l) Hàm lượng pepton
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hƣởng của các HL pepton tới quá trình lên men của chủng nấm men S.cerevisiae M3
Từ bảng số liệu và biểu đồ ta thấy rằng nguồn nitơ hữu cơ từ pepton ở HL 3 – 4 g/l các tế bào nấm men sinh trƣởng, phát triển tốt, SLTB tạo ra nhiều 420 – 490×106
tế bào. Ở HL pepton 1 – 2g/l SLTB nấm men thấp 170 – 230×106 tế bào. Khi HL nitơ trong dịch lên men thấp, có thể dẫn tới sinh trƣởng của nấm men chậm, kéo dài TG lên men hoặc lên men không triệt để, giảm năng suất. Thêm vào đó, số lƣợng các sản phẩm chuyển hóa có thể làm
SLTB × 106
31
giảm chất lƣợng do acid amin và các peptide tạo thành H2S, các este không bình thƣờng và thay đổi sự tạo thành diacetyl. HL pepton 5 – 10g/l ta thấy SLTB nấm men giảm dần từ 340×106 xuống còn 110×106 tế bào. Ở HL pepton cao SLTB nấm men sinh trƣởng, phát triển chậm do môi trƣờng quá giàu chất dinh dƣỡng. Kết quả nghiên cứu này là phù hợp với một số tác giả trƣớc Vũ Thu Hồng [7].
Vì vậy tôi thấy rằng nguồn nitơ hữu cơ từ pepton ở HL pepton 3 – 4 g/l là thích hợp để bổ sung vào quá trình lên men.
3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ
3.2.2.1. Xác định nguồn nitơ vô cơ phù hợp với sự sinh trưởng, phát triển chủng nấm men S.cerevisiae M3
Nguồn nitơ vô cơ cũng có ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng, phát triển của tế bào nấm men. Để xác định nguồn nitơ vô cơ nào là phù hợp của chủng nấm men S.cerevisiae M3 chúng tôi tiến hành thí nghiêm trong môi nhân giống với các nguồn nitơ khác nhau là (NH4)2SO4, KNO3, KNO2 nồng độ 0,2%. HL men