3.2.1. Thử hoạt tính sinh học
3.2.1.1. Tác dụng ức chế HDAC
Các acid hydroxamic 5a-f được thử nghiệm tác dụng ức chế HDAC tại khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc). Kết quả được trình bày ở bảng 3.10 trong phần bàn luận.
3.2.1.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
Các chất 5b-f được đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư người trên dòng tế bào ung thư đại tràng (SW620). Kết quả hoạt tính của chất 5a trích dẫn từ luận văn thạc sĩ của Đỗ Thị Ánh Tuyết [4]. Kết quả giá trị IC50 cụ thể của các chất được trình bày ở bảng 3.10 trong phần bàn luận.
3.2.2. Đánh giá mức độ giống thuốc
Bảng 3.9: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 5a-f theo quy tắc Lipinsky
Chất R LogP KLPT Số NH, OH Số N, O Số liên kết linh động 5a H 1,35 348 3 7 3 5b 4-N(CH3)2 1,53 391 3 8 3 5c 4-F 1,55 366 3 7 3 5d 4-Br 2,24 427 3 7 3 5e 4-CH3 1,90 362 3 7 3 5f 2,6-Cl2 2,64 417 3 7 3
41
Nhận xét :Tất cả các chất đều thỏa mãn được 5 yêu cầu của quy tắc Lipinsky về độ giống thuốc. Cùng với kết quả hoạt tính sinh học in vitro tốt, các chất có nhiều triển vọng cho việc nghiên cứu tác dụng in vivo.
3.3. BÀN LUẬN
3.3.1. Tổng hợp hóa học
Các chất 5a-f và các chất trung gian mà chúng tôi tổng hợp nhìn chung là các chất có cấu tạo phức tạp, có mạch C dài, có các nhóm chức nhạy cảm với các yếu tố của môi trường phản ứng. Vì vậy khi thực hiện phản ứng chúng tôi cần đảm bảo nghiêm ngặt về điều kiện phản ứng. Cụ thể:
- Với phản ứng tổng hợp các ester 4a-f, cần đảm bảo dụng cụ phải khô hoàn toàn, các hóa chất và dung môi phải khan nước. Vì CDI dễ bị phân hủy và không còn khả năng hoạt hóa acid monomethyl suberic nếu tiếp xúc với nước.
- Với phản ứng tổng hợp acid hydroxamic 5a-f: để tránh phân hủy ester thành acid carboxylic bởi dung dịch NaOH đậm đặc, cần làm lạnh hỗn dịch chất 4a-f và dung dịch NaOH trước khi cho vào bình phản ứng. Phản ứng cũng cần tiến hành ở nhiệt độ thấp với thời gian phản ứng ngắn để tránh phân hủy nhóm amid. Lượng NaOH phải dùng dư để chuyển hết NH2OH.HCl thành NH2OH tan và đồng thời đảm bảo các acid hydroxamic tạo thành tan hết trong dung dịch phản ứng.
3.3.2. Tác dụng sinh học
Để hỗ trợ trong quá trình thiết kế cấu trúc và tìm hiểu khả năng gắn vào trung tâm hoạt động trên enzym HDAC của các chất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu docking với 6 chất 5a-f. So sánh mô hình tương tác với HDAC8 của các chất 5a-f
và SAHA có thể thấy phần cầu nối giữa nhóm khóa hoạt động và nhóm gắn với Zn2+ của 6 chất cũng như của SAHA có cấu trúc tương đối giống nhau. Như vậy cầu nối với độ dài 6C của các chất tổng hợp được có nhiều khả năng đưa được nhóm - NHOH tiến gần ion Zn2+ giống như SAHA. Bên cạnh đó, năng lượng liên kết của các chất 5a-f với trung tâm hoạt động của HDAC8 được dự đoán từ -7,4 đến -6,6 kcal/mol, nghĩa là đều lớn hớn so với SAHA (-4,4 kcal/mol), chứng tỏ các chất có ái lực với HDAC8 mạnh hơn SAHA. Có thể giải thích do trong nhóm nhận diện bề
42
mặt của cả 6 chất này đều có nguyên tử S và N làm tăng tương tác Van der Waals của các chất với các acid amin trên miệng túi của enzym HDAC8. Tóm lại, kết quả docking cho thấy các chất 5a-f phù hợp với hướng thiết kế cấu trúc nhằm tìm kiếm những chất có khả năng ức chế HDAC. Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiếp tục tiến hành tổng hợp hóa học và thử tác dụng sinh học.
Bảng 3.10: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thư
Chất R Tác dụng ức chế HDAC1 Độc tính tế bào (IC50) 2 (g/ml) (M) 5a H +3 4,690 13,477 5b 4-N(CH3)2 + 1,070 2,737 5c 4-F + 0,394 1,077 5d 4-Br + 0,857 2,007 5e 4-CH3 + 1,878 5,188 5f 2,6-Cl2 + 3,296 7,904 SAHA + 0,976 3,697
Ghi chú: 1Hoạt tính của enzym bị ức chế hoàn toàn khi thử tại 10g/mL bằng phương pháp Western Blot; 2Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư SW620; 3Hiện tượng deacetyl hóa không xảy ra (hoạt tính của enzyme bị ức chế hoàn toàn).
Kết quả thử tác dụng trên enzym HDAC cho thấy cả 6 chất 5a-f đều làm cho hoạt tính enzym bị ức chế hoàn toàn khi thử tại nồng độ 10 µg/ml bằng phương pháp Western Blot. Từ kết quả này có thể kết luận cả 6 chất tổng hợp được đều có tác dụng ức chế HDAC.
Tác dụng ức chế HDAC quyết định tác dụng kháng tế bào ung thư, tuy nhiên để gây ra độc tính với tế bào các chất phải có khả năng thấm qua màng sinh học vào trong tế bào tiếp cận với HDAC. Do đó chúng tôi tiếp tục tiến hành thử độc tính tế bào in vitro nhằm tìm ra những chất thực sự có tác dụng sinh học tốt. Thử nghiệm tiến hành trên dòng tế bào ung thư đại tràng SW620 cho thấy IC50 của các đều nhỏ hơn 20 µg/ml, tức là cả 6 chất đều có hoạt tính kháng tế bào ung thư SW620. Do các chất tác dụng theo cơ chế phân tử nên để so sánh hoạt tính giữa các chất chúng
43
tôi quy đổi giá trị IC50 từ µg/ml sang µM. Khi đó giá trị IC50 của 5a-f là từ 1,007 µM đến 13,477 µM, so với SAHA (IC50= 3,697 µM) chúng tôi có 3 chất 5b, 5c, 5d
có tác dụng tốt hơn, các chất còn lại nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư đều tương đối thấp. Kết quả thử độc tính tế bào cũng cho thấy sự thay đổi nhóm thế trên khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol mang lại hoạt tính kháng tế bào ung thư khác nhau rõ rệt. Cụ thể, chất 5a không mang nhóm thế trên nhân phenyl có hoạt tính thấp nhất (IC50= 13,477 µM), nhưng khi có nhóm thế dù là nhóm hút hay đẩy điện tử thì hoạt tính cũng tăng lên đáng kể. So sánh hoạt tính của các chất với
5a có thể thấy, chất 5b có thêm 1 nhóm đẩy điện tử ( -N(CH3)2) ở trên nhân phenyl thì IC50 giảm khoảng 5 lần, chất 5e cũng mang nhóm đẩy điện tử -CH3 trên nhân phenyl có IC50 giảm 2,5 lần. Với chất 5c, 5d có nhóm thế hút điện tử (-F, -Br) giá trị IC50 còn thấp hơn rất nhiều và thấp hơn cả SAHA. So sánh với chất có nhóm thế 4- Cl đã công bố trước đây trong luận văn thạc sĩ của Đỗ Thị Ánh Tuyết thì 5c cũng có độc tính trên dòng tế bào SW620 cao hơn (IC50 = 1,007 µM với 1,63 µM). Tuy nhiên, chất 5f có 2 nhóm thế trên nhân phenyl tác dụng độc tính tế bào lại giảm so với các chất có 1 nhóm thế, mặc dù vẫn cao hơn chất không có nhóm thế. Có thể do 2 nhóm thế của chất 5f làm mặt phẳng của vòng benzen xoay đi nhiều so với vòng thiadiazol và cấu trúc này không phù hợp với trung tâm hoạt động của HDAC. Tóm lại, sự có mặt của 1 nhóm thế trên nhân phenyl là cần thiết đối với các dẫn chất N1- hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid để có hoạt tính sinh học tốt hơn SAHA.
Với những kết quả thu được có thể khẳng định cầu nối giữa khung 5-phenyl- 1,3,4-thiadiazol và nhóm NHOH có độ dài 6C là phù hợp để đem hoạt tính ức chế HDAC cũng như độc tính trên tế bào ung thư và khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol có nhiều triển vọng thay thế nhân phenyl của SAHA nhằm tìm ra các các chất ức chế HDAC mới.
Thêm vào đó, các chất đích 5a-f đã tổng hợp được không chỉ có hoạt tính sinh học cao mà còn thỏa mãn cả 5 yêu cầu của quy tắc Lipinsky, điều này mở ra triển vọng cho việc nghiên cứu cận lâm sàng và lâm sàng của các chất sau này. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày có thể rút ra một số kết luận sau:
1.1. Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc
* Đã tổng được 6 chất như dự kiến, trong đó 5 chất 5b-f chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu nào:
- N1-hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid (5a). - N1-{5-[4-(dimethylamino)phenyl]-1,3,4-thiadiazol-2-yl}-N8- hydroxyoctandiamid (5b). - N1-[5-(4-flourophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (5c). - N1-[5-(4-bromophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (5d). - N1-hydroxy-N8-[5-(4-methylphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (5e). - N1-[5-(2,6-diclorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (5f).
* Đã khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp được nhờ phân tích các dữ liệu phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR.
1.2. Về hoạt tính sinh học
* Đã thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được, kết quả cho thấy:
- Về tác dụng ức chế HDAC: cả 6 chất đều có tác dụng ức chế HDAC.
- Về tác dụng kháng tế bào ung thư: cả 6 chất đều có hoạt tính ức chế mạnh với dòng tế bào ung thư đại tràng SW620. Trong đó chất 5c (IC50 = 1,007 µM) có tác dụng mạnh nhất, mạnh gấp 3 lần so với SAHA (IC50 = 3,697 µM).
II. KIẾN NGHỊ
- Tiến hành thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của các chất tổng hợp được trên các dòng tế bào ung thư khác, tìm ra chất có tác dụng mạnh làm cơ sở cho việc thử tác dụng in vivo.
-Nghiên cứu tổng hợp dãy chất thay thế khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol bằng các nhóm đẳng cấu điện tử và các vòng thơm khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Hải Nam, (2010), Liên quan cấu trúc và tác dụng sinh học, Tài liệu sau đại học, NXB Y học.
2. Nguyễn Đình Triệu, (2001), Các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý, NXB Khoa học kỹ thuật, trang 29-100; 195-228.
3. Trương Thanh Tùng, (2012), Tổng hợp một số acid hydroxamic hướng ức chế histon deacetylase, Khóa luận Dược sĩ Đại học, Đại học Dược Hà Nội.
4. Đỗ Thị Ánh Tuyết, (2012), Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5- phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl hướng ức chế enzym histon deacetylase, Luận văn thạc sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội.
Tiếng Anh
5. Anandan S.K., et al., (2007), “Design and synthesis of thiazole-5-hydroxamic acids as novel histone deacetylase inhibitors”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17(21), p. 5995-5999.
6. Andrianov V., et al., (2009), “Novel amide derivatives as inhibitors of histone deacetylase: Design, synthesis and SAR”, European Journal of Medicinal Chemistry, 44(3), p. 1067-1085.
7. Bereshchenko O.R., et al., (2002), “Acetylation inactivates the transcriptional repressor Bcl6”, Nature Genetics, 4, p. 606-613.
8. Bonchain G., et al., (2003), “Development of potential antitumor agents: Synthesis and biological evaluation of a new set of sulfamide derivatives as histone deacetylase inhibitors”, J.Med.Chem, 46, p. 822-830.
9. Bradbury R.H. and Angibaud P., (2007), Cancer: Topics in medicinal chemistry,
Springer Berlin, New York.
10. Chemistry: Association of official Analytical Chemists., Infrared and Ultraviolet spectra of some compounds of Pharmaceutical Interest, Association of official Analytical Chemists, Washington.
11. Chemistry: Society of Afric, Instrumental analysis 201 Ultraviolet visible and infrared spectrophotometry, University of technology Path Western Australia, Path Western, Australia.
12. Chen C.S., et al., (2007), “Histone deacetylase inhibitors sensitize prostate cancer cells to agents that produce DNA double strand breaks by targeting Ku70 acetylation”, Cancer Res., 67, p. 5318-5327.
13. Chen P.C., et al., (2008), “Synthesis and structure-activity relationship of histone deacetylase (HDAC) inhibitors with triazole – linked cap group”, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bioorganic & Medicinal Chemistry, 16(9), p. 4839-4853.
14. Choi Y., et al., (2008), “Histone deacetylase inhibitors KBH-A42 inhibits cytokine production in RAW 264.7 macrophage cells and in vivo endotoxemia model”, Experimental and Molecular Medicine, 40, p. 574-581.
15. Cross A.D., (1960), An Introduction to Pratical Infrared Spectroscopy, Butter Worths Scientific Pub, London.
16. Dallavalle S., et al., (2009), “Design, synthesis, and evaluation of biphenyl-4- yl-acrylohydroxamic acid derivatives as histone deacetylase (HDAC) inhibitors”, European Journal of Medicinal Chemistry, 44(5), p. 1900-1912. 17. Dehmel F., et al., (2008), “Trithiocarbonates as a novel class of HDAC
inhibitors : SAR studies, isoenzyme selectivity, and pharmacological profiles”,
J.Med.Chem, 51, p. 3985-4001.
18. Di Marcotullio L., et al., (2011), “Protected from the inside : Endogenous histone deacetylase inhibitors and the road to cancer”, Biochimica et Biophysia Acta, 1815, p. 241-252.
19. Dow G.S., et al., (2008), “Antimalarial activity of phenylthiazol- bearing hydroxamate-based histone deacetylase inhibitors”, Antimicrobial agents and chemotherapy, 52, p. 3467-3477.
20. Edward S. and Douglas W.C., (2000), “Histone deacetylases, transcriptional control, and cancer”, Journal of Cellular Physiology, 184(1), p. 1–16.
21. Fazi F., et al., (2005), “Retinoic acid targets DNA – methyltransferase and histone deacetylases during APL blast differentiation in vitro and in vivo”,
Oncogene, 24, p. 1820-1830.
22. Gregogetty I.V., (2004), “Molecular evolution of the histone deacetylase family : functional implications of phylogenetic analysis”, J.Mol.Biol.,338, p. 17-31. 23. Halkidou K., et al., (2004), “Upregulation and nuclear recruitment of HDAC1
in hormone refractory prostate cancer”, Prostate, 59, p. 177-189.
24. Hanessian S., et al., (2007), “ω-Alkoxy analogues of SAHA (vorinostat) as inhibitors of HDAC: A study of chain-length and stereochemicaldependence”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17(22), p. 6261-6265.
25. Herbert B., (1967), Mass spectrometry of organic compounds, Holden day Inc. 26. John R.S. and Collegues A., (2004), “Structural Snapshots of Human HDAC8
Provide Insights into the Class I Histone Deacetylases”, The Journal of Structure, 12(7), p. 1325-1334.
27. Jonhstone R.W., (2002), “Histone deacetylase inhibitors: Novel drugs for the treatment of cancer”, Nature, 1, p. 287-299.
28. Khosravi-Far R., et al., (2008), “Programmed cell death in cancer progression and therapy, Advances in experimental medicine and biology”, 615, Springer: Berlin.
29. Kim D., et al., (2003), “Synthesis and biological evaluation of 3-(4-substituted- phenyl)-N-hydroxy-2-propenamides, a new chass of histone deacetylse inhibitors”, J.Med.Chem., 46, p. 4745-5751.
30. Kim H.J, Bae S.C., (2011), “Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs”, Am J Transel Res, 3(2), p. 166-179.
31. Kozikowski A.P., et al., (2008), “Chemistry, biology and QSAR studies of substituted biaryl hydroxamates and mercaptoacetamides as HDAC inhibitors – Nanomolar – Potency inhibitors of pancreatic cancer cell growth”,
32. Kozikowski A.P., et al., (2008), “Use of the Nitrile oxide cycloaddition (NOC) reaction for molecular probe generation: A new class of enzyme selective histone deacetylase inhibitors showing picomolar activity at HDAC 6”,
J.Med.Chem, 51, p. 4370-4373.
33. Lipinski C.A., et al., (1997), “Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings”, Advanced Drug Delivery Reviews, 46(3-26), p. 3–26.
34. Lu A., et al., (2011), “Design, synthesis and docking studies on benzamide derivatives as histone deacetylase inhibitors”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 21, p. 4924-7.
35. Marks P.A., et al., (2001), “Histone deacetylses and cancer: Causes and therapies”, Macmillian magezines, 1, p. 194-200.
36. Marzio G., et al., (2000), “E2F family members are differentially regulated by reverisible acetylation”, J.Biol.Chem., 275, p. 10887-92
37. Mercurio C., Minucci S., Pelicci P.G., (2010), “Histone deacetylases and epigenetic therapies of hematological malignancies”, Pharmacol.Res., 62, p. 18- 34.
38. Mogal A. and Abdulkadir S.A., (2006), “Effects of Histone Deacetylase Inhibitor (HDACi); Trichostatin-A (TSA) on the expression of housekeeping genes”, Mol Cell Probes, 20(2), p. 81-6.
39. Monneret Claude, (2005), “Histone deacetylase inhibitors”, Eur.J.Med.Chem, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
40, p. 1-13.
40. Nam N.H., et al., (2011), “Benzothiazole-containing hydroxamic acids as histone deacetylase inhibitors and antitumor agents”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 21(24), p. 7509–7512.
41. Nam N.H., et al., (2011), “Novel Hydroxamic acids having histone deacetylase inhibiting activity and pharmaceutical composition for treating cancer comprising the same as active ingredient”, Korean patent No 10-2011-0050864.
42. Olson A.J. and Trott O., (2010), “AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading”, J. Comput. Chem 31, p. 455-461.
43. Ruijter de A.J., et al., (2003), HDACs: Characterization of classical HDAC family, J.Biol.Chem., 370, p. 737-49.
44. Seto E. and Glozak M.A., (2007), “Histone deacetylases and cancer”, Oncogene, 26, p. 5420-5432.
45. Song J., et al., (2005), “ Increased expression of histone deacetylase 2 is found in human gastric cancer”, APMIS, 113, p. 264-268.
46. Wahhab A., et al., (2009), “Sulfamides as novel histone deacetylases inhibitors”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19, p. 336-340.
47. Wilson A.J., et al., (2006), “HDAC3 and other class I HDACs regulate colon cell maturation and p21 expression and are deregulated in human colon cancer”,
J.Biol.Chem., 281, p. 13548-13558.
48. Yang X.J. and Seto E., (2007), “HATs and HDACs: from structure,function and