Các chất tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR.
- Phổ hồng ngoại (IR): được ghi tại khoa Hóa, trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000- 600 cm-1. Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
- Phổ khối lượng (MS): được đo bằng máy khối phổ HP 5989B-MS của Viện Hóa học Việt Nam, chế độ đo LC-MS, dung môi methanol.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và carbon 13C-NMR được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dung môi DMSO-d6. Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
2.3.2. Thử tác dụng sinh học
2.3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng (SW620). Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các
18
mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. Chi tiết cách tiến hành dựa trên phương pháp đã được công bố trước đây [4].
2.3.2.2. Thử độc tính tế bào
* Nguyên tắc thử
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT và giá trị IC50 được tính trên phần mềm GraphPad Prism [8,34].
Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thư đại tràng).
Các tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò). Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp MTT theo các bước sau:
Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104 đến 3,5.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 l. Các đĩa sau đó được ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2. Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 l môi trường RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 l mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%.
Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 l thuốc nhuộm MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) với nồng độ MTT là 5 mg/mL trong muối đệm phosphat - PBS. Các đĩa được ủ thêm 3 giờ ở 37oCtrong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi giếng được cho 100 l dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan được hòa tan. Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm.
* Tính kết quả
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy): kết quả cuối
19
cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5%. Giá trị IC50 được tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism. Trong phương pháp thử này, IC50 20 g/mL được coi là có hoạt tính.
2.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được
Tính giá trị logP của các chất tổng hợp bằng phần mền EPTsuite cung cấp bởi US Environmental Protection Agency's Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC). Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đưa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính các giá trị logP.
Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinsky [33]: + Khối lượng phân tử của chất không lớn hơn 500 g/mol.
+ Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10. + Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5. + Giá trị logP của chất không lớn hơn 5.
20
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. HÓA HỌC
3.1.1. Nghiên cứu Docking
Để tìm hiểu sơ bộ về khả năng tương tác của các chất với mục tiêu phân tử là các HDAC, chúng tôi nghiên cứu và dự đoán năng lượng liên kết các chất trong thiết kế với trung tâm hoạt động của HDAC8. Kết quả được minh họa bằng mô hình tương tác của các chất với HDAC8 (hình 3.1), năng lượng liên kết dự đoán được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả docking của các chất 5a-f với HDAC8
Chất 5a 5b 5c 5d 5e 5f SAHA R H 4-N(CH3)2 4-F 4-Br 4-CH3 2,6-Cl2 Năng lượng tương tác (kcal/mol) -6,7 -7,1 -6,9 -6,6 -7,4 -6,8 -4,4
21 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.1: Mô hình tương tác của 6 dẫn chất 5a-f với HDAC8
3.1.2. Tổng hợp hóa học
Quá trình tổng hợp 6 chất trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ chung như sau (sơ đồ 3.1):
Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung
Tác nhân và điều kiện: i) Thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng, hồi lưu, 4 h; ii)
FeCl3.6H2O, ethanol, hồi lưu, 3 h; iii) Acid monomethyl suberic, carbonyldiimidazol, DMF, 60oC, 24 h; iv) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, methanol, -10oC, 1 h.
22
3.1.2.1. Tổng hợp “N1-hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid” (5a)
a. Tổng hợp chất 2a
Chất 2-benzylidenhydrazincarbothioamid (2a) được tổng hợp từ benzaldehyd (1a) qua phản ứng ngưng tụ với thiosemicarbazid có xúc tác là acid hữu cơ theo sơ đồ 3.2:
Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất 2a
Tiến hành phản ứng:
+ Lấy 0,2 ml (2 mmol) benzaldehyd cho vào bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml, thêm 20 ml ethanol khan.
+ Thêm 0,218 g (2,4 mmol) thiosemicarbazid và 3-4 giọt acid acetic băng vào bình phản ứng.
+ Đun hồi lưu kết hợp khuấy từ 300 vòng/phút, tiến hành phản ứng trong 4 h. Xử lý phản ứng:
+ Cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không trong 5 phút ở nhiệt độ 40oC.
+ Thêm 20 ml nước cất để tủa sản phẩm. + Lọc, rửa tủa 3 lần bằng 15 ml nước cất lạnh. + Sấy khô tủa ở 60oC và thu được 0,32 g sản phẩm. Kết quả
+ Cảm quan: bột kết tinh màu trắng ngà. + Hiệu suất: 90%.
+ Tonc: 164-165oC.
+ Rf = 0,63 (DCM/MeOH = 9/1).
23
Tổng hợp chất 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-amin (3a) từ 2a bằng phản ứng đóng vòng nội phân tử theo sơ đồ 3.3 như sau:
Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất 3a
Tiến hành phản ứng:
+ Hòa tan 1,22 g (4,5 mmol) FeCl3.6H2O vào 3 ml ethanol trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml.
+ Hòa tan 0,268 g (1,5 mmol) chất 2a vào 20 ml ethanol trong cốc có mỏ, rót vào bình phản ứng.
+ Đun hồi lưu kết hợp khuấy từ 300 vòng/phút, tiến hành phản ứng trong 3 h. Xử lý phản ứng:
+ Cất loại dung môi bằng máy cất quay trong 5 phút ở nhiệt độ 40oC. + Thêm 20 ml nước cất lạnh vào hỗn hợp phản ứng.
+ Kiềm hóa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 30% đến pH = 8-9.
+ Chiết thu sản phẩm bằng DCM (chiết 3 lần mỗi lần 20 ml DCM), gộp các dịch chiết và lắc với nước muối bão hòa, thu và làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 khan, cất quay chân không ở 40oC đến khi hết dung môi và sản phẩm kết tinh ở dạng rắn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Sấy sản phẩm ở 60oC trong 4 h, thu được 0,19 g. Kết quả
+ Cảm quan: bột kết tinh màu vàng nhạt. + Hiệu suất: 72%.
+ Tonc: 192-194oC.
+ Rf = 0,54 (DCM/MeOH = 9/1).
24
Chất methyl 8-oxo-8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-ylamino)octanoat(4a) được tổng hợp bằng phản ứng acyl hóa hợp chất 3a với acid monomethyl suberic theo sơ đồ 3.4 như sau:
Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp chất 4a
Tiến hành phản ứng:
+ Hòa tan 0,162 g (1 mmol) CDI và 0,17 ml (1 mmol) acid monomethyl suberic vào 1 ml DMF trong bình phản ứng, hoạt hóa ở nhiệt độ phòng trong 1 h.
+ Tiếp tục cho 0,177 g (1 mmol) chất 3a vào bình phản ứng.
+ Duy trì nhiệt độ phản ứng ở 60oC kết hợp khuấy từ 300 vòng/phút, tiến hành phản ứng trong 24 h.
Xử lý phản ứng:
+ Làm lạnh bình phản ứng, thêm từ từ 20 ml dung dịch HCl 5% lạnh vào bình, vừa thêm vừa lắc đều. Để lạnh 30 phút để tủa sản phẩm.
+ Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất đến khi dịch lọc trung tính. + Sấy khô tủa ở 60oC, thu được 0,22 g sản phẩm.
Kết quả
+ Cảm quan: bột kết tinh màu trắng hơi hồng. + Hiệu suất: 65%.
+ Tonc: 236-238oC.
+ Rf = 0,81 (DCM/MeOH = 9/1).
d. Tổng hợp chất 5a
Chất N1-hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid (5a) được tổng hợp bằng phản ứng tạo acid hydroxamic giữa chất 4a với hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ 3.5 như sau:
25
Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp chất 5a
Tiến hành phản ứng:
+ Cho 0,174 g (0,5 mmol) chất 4a và 0,35 g (5 mmol) hydroxylamin hydroclorid vào bình cầu dung tích 50 ml, thêm 5 ml methanol, đem siêu âm 5 phút để tạo hỗn dịch đồng nhất.
+ Hòa tan 0,8 g (20 mmol) NaOH vào 3 ml nước cất trong ống nghiệm.
+ Đồng thời làm lạnh bình phản ứng và dung dịch NaOH xuống dưới 0oC bằng hỗn hợp nước đá muối. Thêm từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng. Duy trì nhiệt độ phản ứng ở -10oC kết hợp khuấy từ 300 vòng/ phút, phản ứng kết thúc sau 1 h. Theo dõi tiến trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách dùng dung dịch FeCl3 5% và TLC, cụ thể làm như sau:
- Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng trên khay sứ, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeCl3 5%, nếu xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ đã có acid hydroxamic được tạo ra.
- Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng trong vial, thêm methanol để hòa tan tủa, kiểm tra bằng TLC với pha động DCM/MeOH/CH3COOH = 90/10/1. Kết thúc phản ứng khi kết quả cho thấy đã phản ứng hết ester ban đầu.
Xử lý phản ứng:
+ Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl 5% lạnh đến pH = 6-7, để lạnh 15 phút để tủa sản phẩm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh.
+ Sấy khô tủa ở 60oC, thu được 0,09 g sản phẩm. Kết quả
+ Cảm quan: bột kết tinh màu trắng. + Hiệu suất: 52%.
26
+ Nhiệt độ nóng chảy và Rf được xác định sau khi kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi methanol - nước, kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 3.2.
+ Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR kết quả cụ thể được trình bày trong phần 3.1.4.
3.1.2.2. Tổng hợp “N1-{5-[4-(dimethylamino)pheny]-1,3,4-thiadiazol-2-yl}-N8- hydroxyoctandiamid” (5b)
Chất 5b được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.6:
Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp 5b
Tác nhân và điều kiện: i) Thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng, hồi lưu, 4 h; ii)
FeCl3.6H2O, HCl 5%, ethanol, hồi lưu, 3 h; iii) Acid monomethyl suberic, carbonyldiimidazol, DMF, 60oC, 24 h; iv) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, methanol, -10oC, 1 h.
a. Tổng hợp chất 2b
Để tổng hợp chất 5b cần tổng hợp chất 2-[4-(dimethylamino)benzyliden] hydrazincarbothioamid (2b). Quá trình tổng hợp chất 2b từ 0,298 g (2 mmol) chất 4-dimethylaminobenzaldehyd (1b) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a. Kết quả như sau:
+ Cảm quan: bột kết tinh màu trắng hơi vàng. + Hiệu suất: 88% (0,391 g).
+ Tonc: 169-170oC.
+ Rf = 0,65 (DCM/MeOH = 9/1).
b. Tổng hợp chất 3b
Tổng hợp chất 5-[4-(dimethylamino)phenyl]-1,3,4-thiadiazol-2-amin (3b) từ
27
Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp 3b
Tiến hành phản ứng:
+ Hòa tan 1,22 g (4,5 mmol) FeCl3.6H2O vào 5 ml ethanol trong bình cầu dung tích 50 ml.
+ Hòa tan 0,333 g (1,5 mmol) chất 2b vào 20 ml HCl 5% trong cốc có mỏ, rót vào bình phản.
+ Đun hồi lưu kết hợp khuấy từ 300 vòng/phút, tiến hành phản ứng trong 3 h. Xử lý phản ứng:
+ Cất loại dung môi bằng máy cất quay trong 1 phút ở nhiệt độ 40oC. + Thêm 10 ml nước cất lạnh vào hỗn hợp phản ứng.
+ Kiềm hóa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 30% đến pH = 8-9.
+ Chiết thu sản phẩm bằng DCM, chiết 3 lần mỗi lần 20 ml DCM, gộp các dịch chiết và lắc với nước muối bão hòa, thu và làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 khan, cất quay chân không ở 40oC đến khi hết dung môi và sản phẩm kết tinh ở dạng rắn.
+ Sấy sản phẩm ở 60oC trong 4 h, thu được 0,23 g. Kết quả
+ Cảm quan: bột kết tinh màu vàng nhạt. + Hiệu suất: 70%.
+ Tonc: 190-191oC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Rf = 0,50 (DCM/MeOH = 9/1).
c. Tổng hợp chất 4b
Tổng hợp chất methyl 8-{5-[4-(dimethylamino)phenyl]-1,3,4-thiadiazol-2- ylamino}-8-oxooctanoat (4b) từ 0,220 g (1 mmol) chất 3b được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 4a. Kết quả của quá trình như sau:
28 + Hiệu suất: 60% (0,23 g). + Tonc: 206-208oC. + Rf = 0,83 (DCM/MeOH = 9/1). d. Tổng hợp chất 5b Tổng hợp chất N1-{5-[4-(dimethylamino)phenyl]-1,3,4-thiadiazol-2-yl}-N8- hydroxyoctandiamid (5b) từ 0,195 g (0,5 mmol) chất 4b được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 5a. Kết quả như sau:
+ Cảm quan: bột kết tinh màu vàng nâu nhạt. + Hiệu suất: 62% (0,12 g).
+ Nhiệt độ nóng chảy và Rf được xác định sau khi kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi methanol - nước, kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 3.2.
+ Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR kết quả cụ thể được trình bày trong phần 3.1.4.
3.1.2.3. Tổng hợp “N1-[5-(4-fluorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxy octandiamid” (5c)
a. Tổng hợp chất 2c
Để tổng hợp chất 5c cần tổng hợp chất 2-(4-fluorobenzyliden) hydrazincarbothioamid (2c). Quá trình tổng hợp chất 2c từ 0,21 ml (2 mmol) chất 4-fluorobenzaldehyd (1c) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a. Kết quả như sau:
+ Cảm quan: bột kết tinh màu trắng. + Hiệu suất: 90% (0,354 g).
+ Tonc: 166-167oC.
+ Rf = 0,60 (DCM/ MeOH = 9/1).
b. Tổng hợp chất 3c
Tổng hợp chất 5-(4-fluorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (3c) từ 0,289 g (1,5 mmol) chất 2c bằng phản ứng đóng vòng nội phân tử tương tự như tổng hợp chất
3a. Kết quả như sau:
29 + Hiệu suất: 71% (0,21 g). + Tonc: 185-186oC. + Rf = 0,55 (DCM/ MeOH = 9/1). c. Tổng hợp chất 4c Tổng hợp chất methyl 8-[5-(4-fluorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-ylamino]-8- oxooctanoat (4c) từ 0,195 g (1 mmol) chất 3c được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 4a. Kết quả của quá trình như sau:
+ Cảm quan: bột kết tinh màu trắng. + Hiệu suất: 62% (0,23 g).
+ Tonc: 196-198oC.
+ Rf = 0,75 (DCM/MeOH = 9/1).
d. Tổng hợp chất 5c
Tổng hợp chất N1-[5-(4-fluorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8- hydroxyoctandiamid (5c) từ 0,182 g (0,5 mmol) chất 4c được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 5a. Kết quả như sau:
+ Cảm quan: bột kết tinh màu trắng. + Hiệu suất: 60% (0,11 g).
+ Nhiệt độ nóng chảy và Rf được xác định sau khi kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi methanol - nước, kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 3.2.
+ Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR kết quả cụ thể được trình bày trong phần 3.1.4.
3.1.2.4. Tổng hợp “N1-[5-(4-bromophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxy octandiamid” (5d)
a. Tổng hợp chất 2d
Để tổng hợp chất 5d cần tổng hợp chất 2-(4-
bromobenzyliden)hydrazincarbothioamid(2d). Quá trình tổng hợp chất 2d từ 0,370 g ( 2 mmol) chất 4-bromobenzaldehyd (1d) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a. Kết quả như sau:
30 + Hiệu suất: 85% (0,44 g). + Tonc: 171-172oC. + Rf = 0,67 (DCM/MeOH = 9/1). b. Tổng hợp chất 3d Tổng hợp chất 5-(4-bromophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (3d) từ 0,387 g (1,5 mmol) chất 2d bằng phản ứng đóng vòng nội phân tử tương tự như tổng hợp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});