III. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ TRIỂN VỌNG
3.2.2. Công nghệ nuôi cấy nguyên bào sợi trong điều trị bỏng
Nguyên bào sợi được phóng đại 400 lần.
Nguyên bào sợi là loại tế bào của trung bì được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy điều trị vết thương, vết bỏng. Vì tính sinh miễn dịch thải ghép thấp cho nên có thể sử dụng nguyên bào sợi da đồng loại. Tác dụng của nguyên bào sợi nuôi cấy là thúc đẩy thời gian liền vết thương bỏng nông (do nó cung cấp một số yếu tố tăng trưởng như TGF-b, PDGF, KGF). Trên vết bỏng sâu, nó có tác dụng làm liền
SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 34 vết bỏng hẹp, cải thiện chất lượng nền ghép cho việc ghép da hay ghép tế bào sừng nuôi cấy, cải thiện chất lượng liền sẹo,…(do nguyên bào sợi tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu mô hóa và cung cấp các sợi laminin, elastin, fibronetin để tế bào biểu mô bám và trượt trên đó giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hóa che phủ vết thương)
Kỹ thuật nuôi cấy nguyên bào sợi gồm các bước chính sau:
Bước 1: Chọn, sàng lọc người cho mẫu da
Mẫu da được lấy ở những người tình nguyện, mạnh khỏe không mắc các bệnh lây nhiễm qua đường máu và các bệnh mạn tính khác. Người càng trẻ càng tốt. Những người cho mẫu da đều được xét nghiệm toàn bộ để loại trừ các bệnh lý nói trên.
Bước 2: Lấy mẫu da và bảo quản mẫu da
Vùng dự kiến lấy mẫu da được vệ sinh sạch sẽ, sát trùng trước khi lấy. Mẫu da lấy có toàn lớp biểu bì, trung bì, hạ bì, kích thước khoảng 1 - 1,5cm2, thường lấy ở trong đùi sát nếp bẹn. Sau khi lấy mẫu da được bảo quản trong ống nghiệm chứa 5ml dung dịch DMEM (Dulbecos Modiffied Eage Media) chứa 1% kháng sinh, bảo quản ở 40C trong vòng 8h, sau đó chuyển mẫu da về labô nuôi cấy.
Bước 3: Xử lý mẫu da
Các mẫu da được cắt lọc hết mỡ sau đó ngâm vào cồn 70% thể tích trong vòng 30 giây, lấy ra rửa sạch 3 lần bằng PBS rồi cắt nhỏ thành các mẩu da kích thước 0,1mm.
Bước 4: Cấy mẫu da
Các mẫu da được cấy trong chai nuôi cấy với mật độ một mẩu da 0,1mm cho diện tích 2,5cm2. Cho môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi vào chai rồi đặt vào tủ ấm 370C với 95% thể tích khí trời và 5% thể tích CO2. Tiến hành bổ sung môi trường nuôi cấy sau 24h và sau 48h tiếp theo. Thay môi trường sau 4 ngày, theo
SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 35 dõi tế bào mọc và di cư ra khỏi mẫu da. Khi nguyên bào sợi phát triển và nhân lên đạt > 50% diện tích che phủ đáy chai nuôi cấy thì tiến hành tách tế bào.
Bước 5: Tách nguyên bào sợi
Lấy bỏ mẫu da và rửa tế bào PBS (phosphate Buffered Salines), thêm dung dịch có 0,05% trypsin và 0,35mM EDTA trong PBS rồi đặt chai nuôi cấy vào tủ ấm 370trong 5 phút. Sau đó kiểm tra mức độ tế bào tách khỏi đáy chai, khi các tế bào co tròn thì cho thêm môi trường nuôi cấy vào và lấy hỗn dịch nuôi cấy đó tiến hành ly tâm với tốc độ 1200v/phút, sau đó bỏ dịch nổi và thu lấy tế bào. Các tế bào này được đưa vào chai nuôi cấy với mật độ 5 × 103tế bào/cm2.
Bước 6: Nhân rộng nguyên bào sợi
Sau một thời gian các tế bào nhân lên trong đĩa nuôi cấy sẽ được cấy chuyển sang các chai khác với mật độ 5000 tế bào/cm2, quy trình cấy chuyển cần theo dõi chặt chẽ tình trạng ô nhiễm, mật độ tế bào, pH môi trường. Các tế bào nuôi cấy và nhân rộng trong môi trường nuôi cấy và đặt trong tủ ấm CO2, cần thay môi trường nuôi cấy cho tế bào sau 3 - 4 ngày.
Bước 7: Thu hoạch nguyên bào sợi
Lựa chọn thế hệ tế bào từ P5-P10, các tế bào đó phải sống và phát triển bình thường. Kiểm tra vi khuẩn và nấm trước khi thu hoạch. Tiến hành thu tế bào từ chai nuôi cấy bằng cách dùng trypsin và ly tâm.
Bước 8: Chuẩn bị giá đỡ tế bào
Giá đỡ tế bào có thể là collagen, các màng sinh học hay tổng hợp. Tại viện bỏng sử dụng tấm vật liệu điều trị vết thương là TegadermR. Giá đỡ được cắt tròn có diện tích đĩa nuôi cấy (75cm2) khử trùng giá đỡ và đặt vào đĩa nuôi cấy, sau đó cho môi trường nuôi cấy vào sao cho láng ngập đều giá đỡ.
SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 36 Đếm tế bào và tính mật độ tế bào rồi dàn đều hỗn dịch tế bào vừa thu được lên giá đỡ đã chuẩn bị. Đặt đĩa nuôi cấy có giá đỡ và tế bào vào tủ nuôi cấy 370C có 5% CO2 trong khoảng 1h rồi bổ sung môi trường nuôi cấy cho đủ 5ml.
Bước 10: Theo dõi và đánh giá tấm tế bào nuôi cấy
Các nguyên bào sợi sẽ nhân lên và phát triển trên giá đỡ trong môi trường nuôi cấy. Theo dõi mật độ tế bào đủ lớn và không có tình trạng nhiễm khuẩn, nhiễm nấm thì tiến hành ghép tấm tế bào nuôi cấy đó lên vết thương, vết bỏng đã được chuẩn bị.
Thông thường thời gian từ khi lấy mẫu da đến khi có thể ghép tấm nguyên bào sợi nuôi cấy lên vết bỏng khoảng 2 tuần[7].
SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 37
