III. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ TRIỂN VỌNG
3.1.1. Việc nuôi cấy nguyên bào sợi, nguyên bào sừng biểu bì
năm đầu thế kỷ XX, với việc sử dụng các môi trường nuôi cấy khác nhau.
Dưới đây là một số môi trường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào sừng - Môi trường có huyết thanh:
Huyết thanh động vật thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy như một nguồn dinh dưỡng cho tế bào phát triển. Trong môi trường nuôi cấy, huyết thanh hoạt động như một chất đệm pH; cung cấp hormon và các nhân tố tăng trưởng; protein; chất dinh dưỡng; chất ức chế các protease;…cần cho sự tăng trưởng và duy trì chức năng cho tế bào sau này.
Nồng độ huyết thanh thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào sừng là 5%, 10%, 20%.
Tuy nhiên, huyết thanh không không phải là nguyên liệu tốt nhất để tạo nên một môi trường tối ưu cho sự tăng trưởng và biểu hiện chức năng của tế bào. Do ta không thể xác định được nguồn gốc tự nhiên của huyết thanh; huyết thanh lại rất dễ bị biến đổi thành phần và dễ bị nhiễm các tác nhân vi nấm, virus,…; một vài nhân tố trong huyết thanh (như HDL, LDL,…) không bền khi bảo quản lâu dài ở nhiệt độ thấp. Mặt khác huyết thanh còn kích thích sự biệt hóa của những tế bào
SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 29 tiến tới trạng thái không phân bào nguyên nhiễm làm cho những tế bào này không duy trì như một dòng tế bào bất tử [25].
- Feeder nguyên bào sợi:
Phương pháp này đầu tiên được mô tả bởi Rheinwald và Green (1975), dựa trên sự nuôi cấy đồng thời tế bào sừng với nguyên bào bị chiếu xạ. Nguyên bào sợi chuột của dòng tế bào 3T3 lấy từ khối u của chuột nhắt bị chiếu xạ liều cao.
Nguyên bào sợi chuột được nuôi trong môi trường D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s medium) có nồng độ glucose cao, bổ sung 10% FBS, Penicillin - Streptomycin (100 UI/ml – 100 µg/ml), dung dịch đệm Bicarbonate sodium 1N với một lượng phù hợp tế bào được chiếu xạ (mục đích để các tế bào này không tăng sinh nhưng vẫn tiết ra một số chất giúp cho sự tăng trưởng của tế bào sừng). Khi những tế bào này tạo được 50% mật độ trong đĩa nuôi cấy thì được sử dụng như một giá thể trực tiếp cho cho việc nuôi cấy tế bào sừng.
Môi trường nuôi cấy tế bào sừng là hỗn hợp giữa môi trường D’MEM (có nồng độ glucose cao) và môi trường Ham’s F12 (có bổ sung 10% FBS) với tỷ lệ là 3:1.
Với tiến bộ kỹ thuật mô hiện nay, các nhà khoa học đã tạo ra nhiều loại màng nhân tạo, bán nhân tạo bằng collagen, polymer,…để sử dụng như một lớp nâng đỡ, tạo điều kiện tốt cho sự tăng trưởng cho tế bào sừng[18].
- Môi trường không huyết thanh:
Môi trường nuôi cấy không sử dụng huyết thanh và các lớp nâng đỡ đã khắc phục được một số hạn chế của việc nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường có huyết thanh hay lớp nâng đỡ.
Mặt khác, do sự thay đổi về cả chất lượng lẫn số lượng các thành phần cơ bản (như các acid amin, vitamin, nguyên tố đa và vi lượng,…) nên cần phải bổ sung vào môi trường các thành phần khác (như EGF, insulin, transferrin, hydrocortisone, dịch trích tuyến yên bò BFE).
SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 30 Tuy nhiên môi trường nuôi cấy này có những hạn chế như: số lượng lần cấy chuyển sau khi nuôi sơ cấp trong môi trường này ít hơn so với môi trường có bổ sung huyết thanh, việc bổ sung các chất cần cho sự tăng sinh của tế bào (như BPE,…) cũng gặp khó khăn (như nguồn cung cấp hiếm, dễ bị nhiễm khuẩn, giá thành cao và đặt biệt là không xác định được nguồn gốc ).
Hiện nay trên thị trường có nhiều môi trường nuôi cấy chuyên biệt tế bào sừng không bổ sung huyết thanh như môi trường MCDB 151, MCDB 153, MCDB 154, Epilife,… Trong đó, môi trường Epilife là môi trường cơ bản để nuôi cấy tế bào sừng và những tế bào biểu bì khác.
Trong môi trường Epilife, tế bào sừng tăng sinh mạnh, khoảng thời gian sống dài và có thể tạo được 45 – 60 thế hệ [19].
