2.3.6.1. Định lượng acid uric máu.
• Định lượng acid uric máu trong huyết tương bằng phương pháp enzym
uricase
Acid uric + O2 +2H2O --- ► Allantoin + CO2 + H2O2
Peroxidas
21
Acid uric bị chuyển thành allantoin và hydroperoxid nhờ uricase. Hydroperoxid phản ứng với 4-aminoantipyrin và 3,5-dichloro-2-hydroxy benzen sulfonic acid (DHBS) tạo thành chromogen được định lượng bởi phương pháp đo quang ở bước sóng 520nm.
- Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric máu trong huyết tương của lô thử so với lô chứng:
I (%) = [(Cc - Ct)/Cc]x 100%
I (%):tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng Cci nồng độ (mg/dl) của lô chứng,
c t: nồng độ (mg/dl) của lô thử.
2.3.6.2. Phương pháp định lượng x o
• Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acỉd uric: Phương pháp của Noro (1983) [27]
Nguyên tắc phản ứng :
Xanthin + O2 + H2O > Acid uric + H2O2
Hỗn hợp phản ứng bao gồm enzym x o và cơ chất xanthin trong môi trường đệm phosphat pH 8,0 được ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 37°c. Phản ứng được ngừng bằng HCl IN, để bất hoạt enzym. Hoạt độ x o được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành trong 1 phút được đo ở bước sóng 290 nm.
Đơn vị hoạt độ (U) của enzym được tính bằng lượng acid uric sinh ra trong 1 phút trên Ig protein ở điều kiện 37°c, pH 8,0. Hàm lượng protein trong gan được định lượng bằng phương pháp Lowry.
22
( E thử " E chứng) ^ ^ > 0 X 1 5
ư /m l= ---
12,2x0,1 X l , Ox T
Công thức tính hoạt độ riêng:
yr/ , . u I ml
ư /g protein = —
Trong đó:
12,2 : Độ hấp thụ milimol phân tò của a.uric tại bước sóng 290nm (mM''.cm'') 6.0 : Thể tích phản ứng (ml)
0,1 : Thể tích enzym cho vào (ml) 15 : Hệ số pha loãng
1.0 : Độ dày cuvet (cm)
T : Thời gian phản ứng (60 phút) K : Số g protein/lg gan.
• Xác định hoạt tỉnh x o bằng phương pháp chiết enzym
Cân khoảng Ig gan, cắt thành các mảnh nhỏ, sau đó cho vào ống nghiền đồng thể, thêm Iml dung dịch đệm phosphat lạnh (pH=8,0) vào. Nghiền đồng thể gan trong điều kiện lạnh ( t < 4*’c ) đến khi thu được dịch đồng thể, sau đó thêm đệm phosphat lạnh để được tỷ lệ (gan: đệm) là (1:15). Dịch nghiền thu được đem ly tâm lạnh ở 0*^c - 4°c với tốc độ vòng 3000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy phần dịch trong thu được sau ly tâm tiếp tục đem ly tâm với tốc độ vòng 10000 vòng/phút trong 60 phút ở 0°c - 4°c. Đem phần dịch trong thu được sau khi ly tâm đem làm phản ứng để xác định hoạt độ enzym [6], [14].
23
Hỗn họp gồm 2,90 ml đệm phosphat (0,05 M, pH 8,0); 2,50 ml dung dịch đệm cơ chất gồm xanthin 0,12 mM, EDTA 0,192mM, kali oxonat 2,2 mM. Dịch enzym và cơ chất được ủ ở 37®c trong 15 phút. Thời gian phản ứng được tính từ lúc thêm 0,10 ml dịch enzym. Tiếp tục ủ trong 60 phút. Sau đó thêm 0,5 ml HCl 1 M để dừng phản ứng, lắc kỹ, đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, thu được dịch trong, đem đo quang ở bước sóng 290 nm.
Song song tiến hành đo;
- Mầu trắng: 5,50 ml đệm phosphat pH 8,0 và 0,50ml HCl 1 M. - Mầu chứng: tiến hành tương tự như trên, nhưng trước khi cho dịch enzym thì 0,5 ml HCl 1 N được cho vào trước để bất hoạt enzym [36].