Ngâm bột dược liệu với dung môi ethanol 70° ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. Dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu cắn. cắn được pha thành hỗn dịch trong nước với tỷ lệ 1:4 để thử trên chuột [12].
2.3.2. Phương pháp đánh giá ảnh hương của dịch chiết đến nồng độ acid uric máu trên chuột bình thưòìig
Chuột nhắt trắng được nuôi ổn định ở môi trường phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành các lô, mỗi lô 10 con.
19
- LÔ chứng: uống nước cất.
- Lô đối chiếu : uống allopurinol liều 20 mg/kg chuột nhắt trắng.
- Các lô thử: uống dịch chiết BLN. 3 lô với 3 liều khác nhau: 5g DL/kg; 1 OgDL/kg, 20g DL/kg (khảo sát liều dựa trên liều dược liệu thông thường)
Chuột được uống mẫu thử trong 5 ngày vào một giờ nhất định. Đến ngày thứ năm, sau khi uống thuốc được 2 giờ, lấy máu, để máu lắng tự nhiên trong khoảng Igiờ ở nhiệt độ phòng rồi đem ly tâm với tốc độ 3500-4000 vòng/phút, trong 10 phút, thu huyết thanh để đi định lượng acid uric [11], [14].
2.3.3. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết đến nồng độ aciduric máu trên mô hình gây tăng acid uric bằng kalỉ oxonat uric máu trên mô hình gây tăng acid uric bằng kalỉ oxonat
Sau thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc đến nồng độ acid uric máu trên chuột bình thường, sẽ lựa chọn liều dùng thích hợp của dịch chiết để gây hạ acid uric trên mô hình tăng acid uric máu thực nghiệm [6],
• B ố tr í th í nghiệm
Chuột nhắt trắng được nuôi ổn định ở môi trường phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành các lô, mỗi lô 10 con.
- Lô chứng: uống nước cất.
- Lô đối chiếu : uống allopurinol với liều 20mg/kg chuột nhắt trắng. - Lô thử; uống dịch chiết lá BLN liều 5g DL/kg chuột.
Chuột được uống mẫu thử tương ứng trong 5 ngày vào một giờ nhất định. Đến ngày thứ năm, tiêm màng bụng kali oxonat 500mg/kg Igiờ trước lần uống thuốc cuối cùng để gây tăng acid uric máu. Sau khi uống thuốc được 2 giờ, lấy máu, đe máu lắng tự nhiên trong khoảng Igiờ ở nhiệt độ phòng rồi đem ly tâm với tốc độ 3500-4000 vòng/phút, trong 10 phút, thu huyết thanh để đi định lượng acid uric [11], [14],
20
2.3.4. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lên hoạt độ xanthỉn oxidase ở gan chuột nhắt trắng bình thường
Chuột nhắt trắng được nuôi ổn định ở môi trường phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành các lô, mỗi lô 10 con.
- Lô chứng: uống nước cất.
- Lô đối chiếu : uống allopurinol liều 20 tng/kg.
- Các lô thử: uống dịch chiết BLN. (3 lô với 3 liều khác nhau: 5g DL/kg; lOgDL/kg, 20g DL/kg)
Các lô chuột được uống mẫu thử tưong ứng trong năm ngày vào rnột giờ nhất định. Đến ngày thứ năm, sau khi uống thuốc 2 giờ, giết chuột lấy gan để xác định hoạt độ xanthin oxidase [6].
2.3.5. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lên hoạt độ xanthinoxỉdase ở gan chuột gây tăng acid uric máu bằng kalỉ oxonat oxỉdase ở gan chuột gây tăng acid uric máu bằng kalỉ oxonat
Bố trí thí nghiệm và tiến hành như miêu tả ở phần 2.3.4. Vào ngày thứ 5, tiêm màng bụng kali oxonat 500mg/kg Igiờ trước lần uống thuốc cuối cùng để gây tăng acid uric. Sau khi uống thuốc được 2 giờ, chuột được mổ lấy gan để xác
định hoạt độ x o [6].
2.3.6. Các phương pháp định lượng các chỉ tiêu hóa sinh.
2.3.6.1. Định lượng acid uric máu.
• Định lượng acid uric máu trong huyết tương bằng phương pháp enzym
uricase
Acid uric + O2 +2H2O --- ► Allantoin + CO2 + H2O2
Peroxidas
21
Acid uric bị chuyển thành allantoin và hydroperoxid nhờ uricase. Hydroperoxid phản ứng với 4-aminoantipyrin và 3,5-dichloro-2-hydroxy benzen sulfonic acid (DHBS) tạo thành chromogen được định lượng bởi phương pháp đo quang ở bước sóng 520nm.
- Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric máu trong huyết tương của lô thử so với lô chứng:
I (%) = [(Cc - Ct)/Cc]x 100%
I (%):tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng Cci nồng độ (mg/dl) của lô chứng,
c t: nồng độ (mg/dl) của lô thử.
2.3.6.2. Phương pháp định lượng x o
• Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acỉd uric: Phương pháp của Noro (1983) [27]
Nguyên tắc phản ứng :
Xanthin + O2 + H2O > Acid uric + H2O2
Hỗn hợp phản ứng bao gồm enzym x o và cơ chất xanthin trong môi trường đệm phosphat pH 8,0 được ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 37°c. Phản ứng được ngừng bằng HCl IN, để bất hoạt enzym. Hoạt độ x o được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành trong 1 phút được đo ở bước sóng 290 nm.
Đơn vị hoạt độ (U) của enzym được tính bằng lượng acid uric sinh ra trong 1 phút trên Ig protein ở điều kiện 37°c, pH 8,0. Hàm lượng protein trong gan được định lượng bằng phương pháp Lowry.
22
( E thử " E chứng) ^ ^ > 0 X 1 5
ư /m l= ---
12,2x0,1 X l , Ox T
Công thức tính hoạt độ riêng:
yr/ , . u I ml
ư /g protein = —
Trong đó:
12,2 : Độ hấp thụ milimol phân tò của a.uric tại bước sóng 290nm (mM''.cm'') 6.0 : Thể tích phản ứng (ml)
0,1 : Thể tích enzym cho vào (ml) 15 : Hệ số pha loãng
1.0 : Độ dày cuvet (cm)
T : Thời gian phản ứng (60 phút) K : Số g protein/lg gan.
• Xác định hoạt tỉnh x o bằng phương pháp chiết enzym
Cân khoảng Ig gan, cắt thành các mảnh nhỏ, sau đó cho vào ống nghiền đồng thể, thêm Iml dung dịch đệm phosphat lạnh (pH=8,0) vào. Nghiền đồng thể gan trong điều kiện lạnh ( t < 4*’c ) đến khi thu được dịch đồng thể, sau đó thêm đệm phosphat lạnh để được tỷ lệ (gan: đệm) là (1:15). Dịch nghiền thu được đem ly tâm lạnh ở 0*^c - 4°c với tốc độ vòng 3000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy phần dịch trong thu được sau ly tâm tiếp tục đem ly tâm với tốc độ vòng 10000 vòng/phút trong 60 phút ở 0°c - 4°c. Đem phần dịch trong thu được sau khi ly tâm đem làm phản ứng để xác định hoạt độ enzym [6], [14].
23
Hỗn họp gồm 2,90 ml đệm phosphat (0,05 M, pH 8,0); 2,50 ml dung dịch đệm cơ chất gồm xanthin 0,12 mM, EDTA 0,192mM, kali oxonat 2,2 mM. Dịch enzym và cơ chất được ủ ở 37®c trong 15 phút. Thời gian phản ứng được tính từ lúc thêm 0,10 ml dịch enzym. Tiếp tục ủ trong 60 phút. Sau đó thêm 0,5 ml HCl 1 M để dừng phản ứng, lắc kỹ, đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, thu được dịch trong, đem đo quang ở bước sóng 290 nm.
Song song tiến hành đo;
- Mầu trắng: 5,50 ml đệm phosphat pH 8,0 và 0,50ml HCl 1 M. - Mầu chứng: tiến hành tương tự như trên, nhưng trước khi cho dịch enzym thì 0,5 ml HCl 1 N được cho vào trước để bất hoạt enzym [36].
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được biểu diễn bằng Xtb ± SE, kết quả được xử lý bằng toán thống kê, so sánh 2 giá trị trung bình bằng Test student trên phần mềm Microsoft Excel 2003.
24
Phần 3: THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.THỰC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ
3.1.1. Ảnh hưởng của dịch chiết lá BLN trên chuột bình thường.
3.1.1.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết [á BLN ở các nồng độ lên nồng độ acid uric máu ở chuột nhắt trắng.
- Bố trí thí nghiệm:
+ Lô chứng; uống nước cất (n = 10)
+ Lô đối chiếu: uống allopurinol liều 20mg/kg chuột nhắt trắng (n = 10) + Các lô thử: uống dịch chiết BLN. (3 lô với 3 liều khác nhau: 5gDL/kg; lOgDL/kg, 20g DL/kg) (n - 10)
Chuột được uống mẫu thử tương ứng với mỗi lô trong 5 ngày vào một giờ nhất định.
Đến ngày thứ 5 tiến hành định lượng và so sánh nồng độ acid uric máu giữa các lô.
25
Bảng 3.1. Ảnh hưửng của dịch chiết BLN lên nồng độ acid uric của chuột nhắt trắng bình thường
STT Lô Nông độ acid uric máu (fxmol/L) p so với chứng Tỷ lệ giảm so với lô chứng (%) 1 Lô chứng 304,06 ± 20,69 2 Lô Allopurinol 217,71 +27,30 p < 0,05 28,4% 3 Lô dịch chiêt (5gDL/kg chuột) 289,52 ± 20,93 p > 0,05 4,78% 4 Lô dịch chiêt (1 OgDL/kg chuột) 325,55 ± 13,17 p > 0,05 -7% 5 Lô dịch chiêt (20gDL/kg chuột) 310,29 ±33,67 p > 0,05 -2%
26 o E 5. 3 3 ■p ‘Ô flj «o- ♦o c z 350 300 250 200 150 100 50 0 400 ' 304.06 325.55 310.29 T 289.52 217.71
Chứng Allopurinol Dich chiết Dịch chiết Dịch chiết
5gDL/kg lOgDL/kg 20gDL/kg
Lo
Hình 3.Ỉ. Ảnh hưởng của dịch chiết BLN iên nồng độ acid urỉc của chuột nhắt trắng bình thường
Nhận xét:
- Allopurinol (liều 20mg/kg) có tác dụng hạ acid uric máu có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p<0,05).
- Các lô uống dịch chiết lá Bằng lăng nước có nồng độ acid uric máu không khác biệt so với lô chứng (p > 0,05).
27
3.1.1.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lá BLN ở các nồng độ lên hoạt độ xanthin oxỉdase ở gan chuột nhắt trắng.
- Bố trí thí nghiệm:
+ Lô chứng: uống nước cất (n = 10)
+ Lô đối chiếu : uống allopurinol liều 20 mg/kg (n = 10)
+ Các lô thử: uống dịch chiết BLN (3 lô với 3 liều khác nhau: 5gDL/kg; lOgDL/kg, 20g DL/kg) (n - 10)
Chuột được uống mẫu thử tương ứng với mỗi lô trong 5 ngày vào một giờ nhất định.
Đến ngày thứ 5 tiến hành định lượng và so sánh hoạt độ enzym xo gan giữa các lô.
28
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của dịch chiết BLN lên hoạt độ xanthỉn oxỉdase ở gan chuột nhắt trắng bình thường STT Lô chuột Hoạt độ enzym xo (mM acid uric/ phút/ g protein gan) % Hoạt độ enzym Mức độ ức chế 1 Lô chứng 2,110 ±0,205 100% 2 Lô allopurinol 1,288 ±0,233 p < 0,05* 61,01% 38,99% 3 Lô dịch chiết (5gDL/kg chuột) 1,244 ±0,078 p < 0,05* p>0,05** 58,96% 41,04% 4 Lô dịch chiết (lOgDL/kg chuột) 1,257 ±0,075 p < 0,05* p > 0,05** p > 0,05*** 59,57% 40,43% 5 Lô dịch chiết (20gDL/kg chuột) 0,934 ±0,103 p< 0,05* p>0,05** p>0,05*** 55,73% 44,26%
(*): so sánh với lô 1 ; so sánh với lô 2; so sánh với lô 3
(Kết quả cho trên bảng là giá trị trung bình của 10 chuột, mỗi gan được tiến hành lặp lại trong 3 lần)
29 2.5 T3 ‘ũ ns 3 I I 15 S o 1 o ã ^ Ồ0 l l l | 0.5 qj a «o- ♦o ö ± 0 2.11 0.934
Chứng Allopurinol Dich chiết Dich chiết Dịch chiết
5gDL/kg lOgDL/kg 20gDL/kg
LÔ
Hlnh 3.2. Ảnh hưởng của dịch chiết BLN lên hoạt độ xanthỉn oxidase ở gan chuột nhắt trắng bình thường
Nhận xét:
- Lô uống allopurinol liều 20mg/kg có hoạt độ xo giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05).
- Các lô uổng dịch chiết lá BLN với các liều khác nhau (5g/kg, lOg/kg, 20g/kg) có hoạt độ enzym x o giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05), không khác biệt với lô uống allopurinol (p > 0,05) và không khác biệt với nhau (p > 0,05).
30
3.1.2. Ảnh hưởng của dịch chiết lá BLN trên mô hình chuột gây tăng acỉd urỉc máu bằng kali oxonat
3.I.2.I. Ảnh hưởng của dịch chiết lá BLN đến nồng độ acid uric máu trên mô hình chuột tăng acid uric máu bằng kali oxonat.
- Bố trí thí nghiệm:
+ Lô chứng: uống nước cất (n = 10)
+ Lô đối chiếu: uống allopurinol 20mg/kg chuột (n = 10)
+ Lô thử: uổng dịch chiết lá BLN liều 5g dược liệu/kg chuột (n = 10)
Chuột được uống mẫu thử tưoTig ứng với mỗi lô trong 5 ngày vào một giờ nhất định.
Đen ngày thứ 5 tiến hành định lượng và so sánh nồng độ acid uric máu giữa các lô.
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của dịch chiết BLN lên nồng độ acỉd uric của chuột nhắt trắng gây tăng acid uric bằng kali oxonat
STT Lô Nông độ acid uric
máu (ụ.mol/L) p so vói chứng
Tỷ lệ giảm so vói lô chứng (%) 1 Lô chứng 346,25 ± 3,93 2 Lô allopurinol 242,31 ± 15,09 p< 0,01* 30,02% 3 Lô dịch chiêt (5gDL/kg chuột) 287,28 ± 19,82 p< 0,01* p>0,05** 17,03%
31 400 350 o £ ĩ 300 3 'ÍTJ 250 É u ‘vl 200 •p ’Ũ 150 ‘O- 100 bO c ,‘0 50 Z 0 346.25 T 287.28 Chứng Allopurinol Dịch chiết 5gDL/kg Lô
Hình 3.3. Ảnh hưởng của dịch chiết BLN lên nồng độ acid uric của chuột nhắt trắng gây tăng acỉd uric bằng kaỉi oxonat
Nhận xét:
- Lô chuột uống allopurinol có nồng độ acid uric giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01)
- Lô uống dịch chiết lá Bằng lăng nước nồng độ acid uric giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01) và không khác biệt so với lô uống allopurinol (p > 0,05)
32
3.I.2.2. Ảnh hưỏìig của dịch chiết lên hoạt độ xanthỉn oxỉdase ở gan chuột gây tăng acỉd uric bằng kali oxonat
- Bố trí thí nghiệm:
+ Lô chứng: uống nước cất (n = 10)
+ Lô đối chiếu: uống allopurinol 20mg/kg chuột (n = 10)
+ Lô thử: uống dịch chiết lá BLN liều 5g dược liệu/kg chuột (n = 10)
Chuột được uống mẫu thử tương ứng với mỗi lô trong 5 ngày vào một giờ nhất định.
Đến ngày thứ 5 tiến hành định lượng và so sánh hoạt độ enzym xo gan giữa các lô.
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4 và hình 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết BLN lên hoạt độ xanthỉn oxỉdase ở gan chuột nhắt trắng gây tăng acid uric bằng kali oxonat
STT Lô chuột Hoạt độ enzym x o (mM acid uric/ phút/ g protein gan) % Hoạt độ enzym Mức đô ức • chế 1 Lô chứng 1,25 ±0,15 100% 2 Lô allopurinol 0,74 ± 0,04 p < 0 ,0 1 * 59,20% 40,80% 3 Lô dịch chiết (5gDL/kg chuột) 0,78 ± 0,02 p < 0 ,0 1 * p>0,05** 62,40% 37,60%
(*): so sánh với lô 1 ; (**): so sảnh với lô 2
(Kết quả cho trên bảng là giá trị trung bình của 10 chuột, mỗi gan được tiến hành lặp lại trong 3 lần)
33 1.6 u ‘ìZ 3 1.4 ’u 1.2 1 c '55 «*-* 1 p o %CLm, 0 .8 X 00 E 0 .6 >« INI ' 3 c J Z Ol 0.4 <o- ♦o 0 .2 05- o X 0 1.25 Chứng 0.74 Aliopurinol LÔ 0.78 Dịch chiết 5gDL/kg
Hình 3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết BLN lên hoạt độ xanthin oxỉdase ở gan chuột nhắt trắng gây tăng acid urỉc bằng kalỉ oxonat
Nhận xét:
- Lô uổng allopurinol có hoạt độ enzym xo giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01).
- Lô uống dịch chiết lá Bằng lăng nước, hoạt độ enzym xo giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01) và không khác biệt so với lô uống allopurinol (p > 0,05)
34
3.2. BÀN LUẬN
3.2.1. về ảnh hưởng của dịch chiết lá Bằng lăng nước đến nồng độ acid uric máu.
Với liều thử nghiệm, trên chuột bình thường, sau 5 ngày dùng dịch chiết lá Bằng lăng nước liên tục, nồng độ acid uric trong máu chuột nhắt trắng bình thường của các lô thử không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng và không phụ rhuộc vào liều. Trong khi đó allopurinol với liều 20mg/kg chuột có tác dụng làm hạ acid uric máu. Như vậy có khả năng trên chuột bình thường dịch chiết không có tác dụng lên nồng độ acid uric hoặc thể hiện tác dụng chưa đủ mạnh để làm thay đổi nồng độ acid uric máu. Nhưng với liều thử nghiệm trên chuột gây tăng acid uric bằng kali oxonat, dịch chiết dược liệu có tác dụng hạ acid uric máu với tỷ lệ giảm 17,03% (p < 0,05). Như vậy Bằng lăng nước chỉ thể hiện tác dụng hạ acid uric máu trên chuột có rối loạn chuyển hoá. Trong nghiên cứu của Trần Thị Thu Phương (2010), cây Hy Thiêm cũng chỉ tác dụng giảm acid uric trên chuột tiêm kali oxonat mà không có tác dụng trên chuột bình