D.1.Nguyên tắc
Chất đạm được vô cơ hóa bằng đậm đặc và chất xúc tác thành muối ammonium sulphate (NH4)2SO4. Muối này đem cho tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng NH3 H2SO4 đậm đặc
Nguyên liệu (NH4)2SO4 xúc tác , t0
(NH4)2SO4 + NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4
Sau đó lượng được lôi cuốn bằng hơi nước sang một bình tam giác có chứa một lượng thừa H3BO3, mà ở đó H3BO3 tự phân ly:
H3BO3 HBO2 + H2O
Khi cất đạm, NH3 bay ra sẽ phản ứng với HBO2
NH4OH + HBO2 NH4+ + BO2- + H2O
BO2- là một bazo mạnh, bởi vậy dung dịch của bình phản ứng chuyển từ màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ. Lượng BO2- được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2- bằng cách
68
chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ.
D.2.Dụng cụ và hóa chất
Máy kjeldahl
NaOH 32%
HCl 0.25N
Chất xúc tác là hỗn hợp của 60g Se: 75g CuSO4: 865g K2SO4.
Hỗn hợp chất chỉ thị màu :
Hòa tan 0.264g methyl đỏ trong 250ml cồn tuyệt đối.
Hòa tan 1.28g bromocreseol blue trong 50ml cồn tuyệt đối.
Trộn đều hai dung dịch trên, bổ sung 96ml HCL 0.25N rồi định mức đến 1000ml bằng cồn tuyệt đối.
Dung dịch acid boric 4% với chỉ thị màu: hòa tan 80g acid boric trong 1000ml nước, đun nóng một chút. Để nguội và bổ sung 25ml hỗn hợp chất chỉ thị màu rồi thêm nước cất cho đủ 2000ml.
D.3.Cách tiến hành
Vô cơ hóa mẫu
Cân 0,1g mẫu đã nghiền kỹ và thêm 5ml đậm đặc và 1g chất xúc tác cho vào bình kjeldahl. Sau khi thêm chất xúc tác cho vào bình Kjeldahl và sau khi thêm chất xúc tác đun nhẹ hỗn hợp, tránh sôi trào và chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dung dịch lỏng. Trong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, tránh khéo léo sao cho không còn một vết đen nào của mẫu nguyên liệu chưa bị phân hủy còn sót lại trên thành bình. Đun cho tới khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng. Khi thời gian phá mẫu kết thúc, khoảng 3 – 4 giờ để nguội rồi chuyển toàn bộ vào bình chưng cất.
69
NaOH 32%. Dịch chưng cất chuyển qua erlen có chứa sẵn 20ml dung dịch acid boric 4% có chỉ thị màu.
Ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra không còn NH3 (không làm đổi màu giấy quỳ). Chuẩn độ bằng HCL 0.25N đến khi xuất hiện màu đỏ phớt.
Thông qua lượng HCL 0.25N đem đi chuẩn độ ta biết được lượng acid boric kết hợp với NH3 và do vậy biết được lượng NH3 giải phóng từ mẫu 1ml HCL 0.25N.
Tương ứng với 0.0035g N hữu cơ…
D.4.Kết quả VHCl * 0.0035*100 N (%) = C Trong đó : VHCl : là thể tích HCL 0.25N dùng để chuẩn độ (ml)
C : là khối lượng mẫu đem đi vô cơ hóa ( g)
Xác định hàm lượng protein trong vỏ tôm, thông thường protein chứa khoảng 16% N.Khí nhận được khi NH3 chưng cất nhân với hệ số chuyển đổi 100/16 ( ~ 6.25) sẽ thu được giá trị protein tương đương .
Vì vậy khi xác định được hàm lượng Nito tổng số theo phương pháp Kjeldahl ta suy ra hàm lượng protein toàn phần là:
HL protein = N (%) * 6.25
E.Thủy phân vỏ tôm bằng phƣơng pháp enzyme protease kết tủa để thu chitin và chitosan
Theo dõi quá trình thủy phân vỏ tôm bằng enzyme protease kết tủa với các nồng độ 5%, 7%, 9% nhiệt độ 40, 50 , 60 0C thời gian từ 2 – 20 giờ
70
Nguyên liệu vỏ tôm khô
Xay nhỏ 2 – 4 mm
Ngâm trong dung dịch enzyme có nồng độ khác nhau (5, 7, 9%)
Với các giá trị nhiệt độ 40, 50, 60, tỷ lệ W: V = 1:10 pH = 7, và trong khoảng thời gian từ 0 – 20 giờ
Đo hàm lượng protein hòa tan
Chọn được nhiệt độ, nồng độ và thời gian thủy phân thích hợp (tại nồng độ mà hàm lượng protein hòa tan thấp nhất )
F. Kiểm tra sản phẩm chitosan thu đƣợc F.1. Định tính chitosan F.1. Định tính chitosan
Để biết chất đó có phải là chitosan hay không người ta có thể dùng phản ứng sau để định tính nhanh chitosan theo tài liệu của Nguyễn Hữu Đức và Võ Thị Tường Khanh (1997):
Cho phản ứng với KMnO4: lấy 0.1 ml KMnO4 Cho vào 10ml dung dịch chitosan 0.5% trong dung dịch acid acetic 1%, dung dịch từ màu tím sang màu vàng nhạt.
F.2.Phƣơng pháp xác định độ hòa tan F.2.1.Nguyên lý
Chitosan được hòa tan trong acid acetic loãng 1% còn chitin và các tạp chất khác không hòa tan.
F.2.2.Tiến hành
Cân chính xác M g chitosan hòa tan trong dung dịch acid acetic 1%, khuấy đều trong 15 phút cho chitosan tan hoàn toàn (nếu còn vớt ra rửa sạch bằng nước cất). Sau đó đem sấy khô và cân lại.
71
X (%) = [(M – m) x 100]/M
Trong đó:
M: là khối lượng của chitosan ( g )