Kumar A. và cs. (1991) [34] cho biết: Trypanosomiasis là một bệnh ký sinh trùng, phổ biến ở cả người và động vật, gây ra bởi ký sinh trùng đơn bào Trypanosoma spp.
Chen Qijun (1992) [27] cho biết: T. evansi gây bệnh cho hầu hết các loài động vật như trâu, bò, ngựa, la, chó… ở Trung Quốc.
Diall O. và cs. (1993) [31] đã nghiên cứu về dịch tễ học bệnh do Trypanosoma sp gây ra ở lạc đà tại Mali. Kết quả điều tra cho thấy: trong 305 mẫu kiểm tra tại Tây Sahel có 29 mẫu dương tính; chiếm tỷ lệ 9,5%. Trong 627 mẫu kiểm tra tại Tombouctou và Gao có 28 mẫu dương trính;
chiếm tỷ lệ 4,5%. Tỷ lệ nhiễm theo đàn là 55% ở Tây Sahel, 68% ở Tombouctou và Gao; ở một sốđàn tỷ lệ nhiễm vượt quá 50%.
Theo Aquino LP và cs. (1999) [25]: chó nhiễm T. evansi có triệu chứng sốt gián đoạn, niêm mạc nhợt nhạt, phù nề, con vật gầy yếu và có thể sờ thấy các hạch bạch huyết sưng to.
Ul Hasan M. và cs. (2006) [43], đã tiến hành một nghiên cứu nhanh để xác định tỷ lệ nhiễm Trypanosoma evansi ở những loại mẫn cảm tại
Punjab (Pakistan). 170 ngựa và 150 lạc đà đã được kiểm tra bằng phương pháp huyết thanh học phát hiện có 6 lạc đà (chiếm 4,0%) và phương pháp xác định ký sinh trùng phát hiện có 5 lạc đà (chiếm 3,3%) nhiễm T. evansi; không phát hiện ngựa nhiễm bệnh.
Umezawa E. S. và cs. (2009) [44] đã sử dụng các phương pháp TESA - blot, TESA - ELISA, epimastigotes - ELISA chẩn đoán chó bị nhiễm Trypanosoma cruzi để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu. Kết quả cho thấy, phương pháp TESA - blot có độ nhạy và độ đặc hiệu 100%; TESA - ELISA có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 94,1%; epi - ELISA có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 49,4%.
Tamarit A. Và cs. (2010) [41] cho biết: Một đợt bùng phát bệnh do
Trypanosoma evansi xảy ra ở Trung Tây Ban Nha được phát hiện. Các ổ dịch xảy ra ở trang trại ngựa, lừa và lạc đà. Bằng phương pháp soi tươi đã xác định được 76% lạc đà, 35% lừa và 2% ngựa nhiễm T. evansi. Các
loài động vật đã được cách ly và điều trị bằng Cymelarsan với liều 0,5 mg/kg. Sau thời gian điều trị, kiểm tra lại máu của số động vật này đều cho kết quả âm tính với T. evansi.
Haridy F. M. và cs. (2011) [32] đã lựa chọn ngẫu nhiên 300 con lạc đà (200 lạc đà đực 4 - 6 tuổi và 100 lạc đà cái 10 - 15 năm tuổi) để xác định tỷ lệ nhiễm bệnh do Trypanosoma evansi. Các phương pháp chẩn đoán gồm chẩn đoán lâm sàng, nhuộm giemsa tiêu bản máu và ELISA. Phương pháp
nhuộm giemsa phát hiện 6,0% lạc đà đực và 9,0% lạc đà cái nhiễm T. evansi. Phương pháp ELISA phát hiện 8,0% lạc đà đực và 24,0% lạc đà cái nhiễm T. evansi. Kết quả cho thấy phương pháp chẩn đoán ELISA có độ nhạy và độđặc hiệu cao hơn phương pháp nhuộm giemsa.
Tonin A. A. và cs. (2011) [42] đã tiến hành nghiên cứu để đánh giá việc sử dụng diminazene aceturate kết hợp với selenite natri và vitamin E trong điều trị bệnh do Trypanosoma evansi. Các tác giả sử dụng 72 chuột cái chia thành 9 nhóm với mỗi nhóm 8 chuột (A, B, C, D, E, F, G, H và I). Nhóm A là nhóm không bị nhiễm bệnh, nhóm B - I được gây nhiễm với liều 0,2 x 106 T. evansi/chuột. Hàng ngày kiểm tra máu chuột bằng phương pháp nhuộm giemsa. Nhóm B không được điều trị, các nhóm còn lại được sử dụng thuốc vào ngày thứ 3 sau gây nhiễm như sau: nhóm C được điều trị với diminazene aceturate; nhóm D với sodium selenite; nhóm E với vitamin E; nhóm F với diminazene aceturate và sodium selenite; nhóm G với diminazene aceturate và vitamin E; nhóm H với diminazene aceturate, sodium selenite và vitamin E; nhóm I với selenite natri và vitamin E. Kết quả cho thấy: Tuổi thọ của chuột ở nhóm điều trị với diminazene aceturate kết hợp với sodium selenite (nhóm F và H) tăng; trong khi nhóm C và G không có sự khác biệt rõ rệt, do đó, vitamin E không làm tăng hiệu quả điều trị T. evansi khi kết hợp với diminazene aceturate. Hiệu quả điều trị bệnh ở các nhóm như sau: nhóm C là 37,5%; nhóm F là 87,7%; nhóm G là 37,7% và nhóm H là 75%. Các phác đồ điều trị khác không có hiệu quả điều trị bệnh do T. evansi.
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Trâu của một số xã thuộc huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang. - Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế tạo theo nguyên lý Card
Agglutination Test for Trypanosomiasis (CATT).
3.1.2. Động vật thí nghiệm và vật liệu nghiên cứu
* Động vật:
- Trâu ở các địa phương của huyện Sơn Dương. - Chuột bạch: 18 – 20 g/con, khỏe mạnh.
* Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
* Hoá chất nghiên cứu:
- Thuốc nhuộm giemsa. - Nước cất. - Dung dịch EDTA 1% - Dung dịch formol 10% - Cồn Methanol - Cồn sát trùng 700 - Dầu bạch dương
* Thuốc để nghiên cứu phác đồđiều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu
- Thuốc trị ký sinh trùng:
+ Berenil: lọ dung dịch 20 ml chứa Diaminazeno aceturato 70 mg, Fenazona (Antipirina) 375 mg. Nhà sản xuất: Intervet Tây Ban Nha.
+ Phar - Trypazen: lọ thuốc bột pha tiêm 1,18 gam chứa 525 mg Diminazen diaceturat. Nhà sản xuất: Công ty thuốc thú y Pharmavet.
+ Trypanosoma: lọ thuốc bột pha tiêm chứa 125 mg Chlorhydrat chlorur isometamidium. Nhà sản xuất: Công ty thuốc thú y Hanvet.
+ Trypamidium samorin: gói thuốc bột pha tiêm 125 mg chứa 125 mg Isometamidium Chloride Hypochloride. Nhà sản xuất: MERIAL Pháp.
- Thuốc trợ tim: Cafein Natri Benzoat 20%. Nhà sản xuất: Công ty thuốc thú y Hanvet.
- Thuốc trợ sức, trợ lực: Nước sinh lý mặn, Vitamin C 5%, Vitamin B1 2,5 %. * Dụng cụ dùng trong nghiên cứu: - Kính hiển vi quang học. - Lam kính. - Lamen. - Kim chích máu. - Tube tráng Heparin.
- Xilanh 1 ml, 3 ml, 5 ml và kim tiêm các loại. - Chuồng nuôi động vật thí nghiệm.
- Một số dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm thu thập mẫu: các nông hộ, các trại chăn nuôi gia đình tại một số xã thuộc huyện Sơn Dương – tỉnh Tuyên Quang.
- Địa điểm xét nghiệm mẫu: Phòng thí nghiệm Khoa Chăn nuôi thú y – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Ứng dụng Kit Card Agglutination Test for Trypanosomiasis
(CATT) xác định tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại một số xã thuộc huyện Sơn Dương - Tỉnh Tuyên Quang
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại huyện Sơn Dương – Tỉnh Tuyên Quang, so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của Kit chẩn đoán với Kit ngoại nhập và phương pháp tiêm truyền chuột bạch.
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi. - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt.
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo các tháng trong năm.
3.3.2. Nghiên cứu phác đồ điều trị bệnh T. evansi cho trâu và đề xuất biện pháp phòng chống biện pháp phòng chống
3.3.2.1. Xây dựng phác đồđiều trị bệnh tiên mao trùng
- Thử nghiệm tính mẫn cảm của tiên mao trùng với một số thuốc trị TMT.
- Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp. - Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện rộng. - Ứng dụng phác đồ có hiệu quả cao trong điều trị bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu ở huyện Sơn Dương - tỉnh Tuyên Quang.
3.3.2.2. Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh T. evansi cho trâu ở huyện Sơn Dương – tỉnh Tuyên Quang Sơn Dương – tỉnh Tuyên Quang
Đề xuất và áp dụng biện pháp phòng chống bệnh TMT trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp thu thập mẫu
3.4.1.1. Phương pháp lấy máu trâu
- Thu thập mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên, phân tầng trên trâu tại huyện Sơn Dương – tỉnh Tuyên Quang.
- Dung lượng mẫu cho đề tài này được tính toán theo công thức của tổ chức WHO (1991):
n = (Z1 - α/2)2 x p (1 - p) d2
Trong đó: n là số mẫu tối thiểu cần đạt được P là tỷ lệ gia súc nhiễm bệnh dự kiến (1- p) là tỷ lệ gia súc không nhiễm bệnh
d là độ chính xác mong muốn (< 0,05 hay hệ số tin cậy 95%) (Z1 - α/2)2 có giá trị 1,96
3.4.1.2. Phương pháp lấy mẫu máu
- Sát trùng vùng tĩnh mạch cổ trâu bằng cồn 700. Dùng xilanh nhựa 3 ml lấy máu tĩnh mạch cổ trâu. Mỗi trâu lấy không quá 1 ml máu, tiêm ngay 0,2 ml máu vào phúc mạc cho chuột bạch, sau đó dùng phiết kính 3 tiêu bản máu. Ghi ký hiệu mẫu; thể trạng trâu; triệu chứng lâm sàng (nếu có); tên chủ hộ; địa chỉ; ngày lấy mẫu. Bảo quản ở 40C.
3.4.1.3. Phương pháp lấy mẫu huyết thanh
- Lấy mẫu máu cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm sao cho diện tích bề mặt máu rộng tối đa. Cốđịnh ống nghiệm cho đến khi máu đông, dựng thẳng ống nghiệm lên để ở nhiệt độ thường hoặc trong tủ ấm 370C, khi thấy ra nhiều huyết thanh thì bỏ ống nghiệm vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 60C trong 2 - 3 tiếng để máu co lại và chắt lấy huyết thanh. Sau khi chắt được huyết thanh, lấy huyết thanh ly tâm 1000 vòng/phút để loại bỏ hồng cầu. Bảo quản huyết thanh ở - 200C.
3.4.2. Phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên các mẫu máu trâu đã thu thập trâu đã thu thập
3.4.2.1. Phương pháp ứng dụng Kit chẩn đoán bệnh
Trên cùng một mẫu máu được hợp cả 3 phương pháp: ứng dụng Kit tự chế tạo theo nguyên lý CATT, Kit ngoại nhập và tiêm truyền chuột
bạch để chẩn đoán bệnh cho đàn trâu của huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang. Từ đó, so sánh và đánh giá hiệu quả chẩn đoán bệnh của Kit tự chế tạo.
Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể lưu động trong máu động vật nhiễm bệnh.
Nguyên lý: kháng nguyên TMT đã được nhuộm màu kết hợp với kháng thể tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh.
Cách tiến hành: dùng ống hút 2,5 ml dung dịch buffer cho vào lọ kháng nguyên chuẩn đã được nhuộm màu (CATT reagent), lắc đều. Cho vào lọ kháng nguyên đối chứng (đối chứng dương, đối chứng âm) mỗi lọ 0,5 ml dung dịch buffer, lắc đều. Dùng micropipette pha loãng huyết thanh theo tỷ lệ cần chẩn đoán (1/8). Cho các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán đã được pha loãng lần lượt vào các vòng tròn của bản CATT, cho kháng nguyên đối chứng vào hai vòng tròn khác của bản, mỗi loại 1 giọt (tương đương 45µl). Sau đó cho vào tất cả các vòng tròn trên bản CATT 1 giọt kháng nguyên chuẩn. Dùng que nhựa trộn đều. Cuối cùng cho lên máy lắc 5 phút (60 - 70 lần/ phút) và đánh giá kết quả.
3.4.2.2. Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm
Dùng máu tươi tiêm trực tiếp cho chuột bạch (không sử dụng chất chống đông).Mỗi chuột tiêm 0,2 ml máu, tiêm vào phúc mạc. Theo dõi biểu hiện của chuột thí nghiệm sau tiêm truyền. Mỗi ngày kiểm tra máu chuột thí nghiệm 1 lần để phát hiện tiên mao trùng bằng phương pháp xem tươi.
3.4.3. Một số quy định trong nghiên cứu đặc điểm dịch tễ
* Quy định về tuổi trâu
- Tuổi trâu nghiên cứu được phân ra theo 4 lứa tuổi: + ≤ 2 năm tuổi
+ > 5 – 8 năm tuổi + > 8 năm tuổi
* Các tháng theo dõi trong năm
Chúng tôi tiến hành theo dõi các chỉ tiêu trong các tháng 1,2,3,4,5.
3.4.4. Xây dựng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng
3.4.4.1. Phương pháp nghiên cứu khả năng mẫn cảm của T. evansi với một số thuốc trị tiên mao trùng trên chuột bạch số thuốc trị tiên mao trùng trên chuột bạch
Thí nghiệm được bố trí trên 160 chuột/4 loại thuốc, mỗi loại sử dụng ở 3 mức liều: thấp hơn, cao hơn và đúng liều khuyến cáo của nhà sản xuất.
40 chuột gây nhiễm T. evansi được bố trí thí nghiệm đối với một loại thuốc. Sau gây nhiễm 3 ngày (máu ngoại vi có khoảng 80 - 100 TMT /vi trường) thì chia thành 2 lô:
- Lô thí nghiệm (gồm 30 chuột): mỗi mức liều tiêm cho 10 chuột. - Lô đối chứng (gồm 10 chuột): không tiêm thuốc.
Sau dùng thuốc, hàng ngày trích máu đuôi chuột kiểm tra bằng phương pháp soi tươi để xác định thời gian sạch tiên mao trùng trong máu. Nếu cả 10 chuột đều sạch tiên mao trùng, sau 15, 20, 30 ngày không thấy tiên mao trùng xuất hiện trở lại thì xác định thuốc có tác dụng tốt với tiên mao trùng ở liều sử dụng. Nếu có chuột không sạch tiên mao trùng hoặc sạch nhưng sau đó xuất hiện trở lại tiên mao trùng thì thuốc có hiệu lực thấp ở liều sử dụng. So sánh với kết quả theo lô đối chứng.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Kết quả thí nghiệm này cho phép xác định được thuốc nào còn hiệu lực cao với tiên mao trùng, thuốc nào đã có thể bị tiên mao trùng quen và kháng lại.
3.4.4.2. Phương pháp nghiên cứu biện pháp trị bệnh tiên mao trùng * Xây dựng phác đồđiều trị: * Xây dựng phác đồđiều trị:
- Qua nghiên cứu về khả năng mẫn cảm của T. evansi trên chuột bạch, chúng tôi lựa chọn thuốc có hiệu lực cao, an toàn để xây dựng 3 phác đồđiều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu. Mỗi phác đồ gồm có:
+ Thuốc diệt tiên mao trùng + Thuốc trợ tim
+ Thuốc trợ sức, trợ lực.
* Thử nghiệm phác đồđiều trị trên diện hẹp:
Mỗi phác đồ được điều trị thử nghiệm cho 3 trâu (có kết quả dương tính với T. evansi bằng Kit chẩn đoán). Xét nghiệm máu trâu sau 5, 10, 15 và 20 ngày điều trị để kiểm tra tác dụng của phác đồ điều trị bằng phương pháp tiêm truyền chuột bạch.
* Thử nghiệm trên diện rộng:
Sau khi thử nghiệm trên diện hẹp, tiếp tục thử nghiệm trên số lượng trâu nhiễm tiên mao trùng nhiều hơn để xác định hiệu quả của mỗi phác đồ điều trị bệnh.Xét nghiệm máu trâu để xác định hiệu lực điều trị bằng phương pháp tiêm truyền chuột bạch. Từ đó, chọn một phác đồ tốt nhất để áp dụng rộng rãi ở các địa phương.
3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được, được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học (Theo tài liệu của Nguyễn Văn Thiện, 2008), trên phần mềm Excel 2003.
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Ứng dụng Kit chẩn đoán để xác định tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang trùng ở trâu tại huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang
4.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở một số xã thuộc huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang tỉnh Tuyên Quang
Trong thời gian nghiên cứu chúng tôi đã thu thập 167 mẫu máu trâu tại 3 xã của huyện Sơn Dương gồm: Tân Trào, Bình Yên và Kháng Nhật. Mỗi mẫu được kiểm tra bằng Kit tự chế và Kit nhập ngoại, sau đó những mẫu máu dương tính được tiêm truyền chuột bạch để phát hiện TMT. Kết quảđược thể hiện qua bảng 4.1.
Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại một số xã thuộc huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang
Địa phương (xã) Số trâu kiểm tra (con) Kit tự chế Kit nhập ngoại MI Số trâu (+) Tỷ lệ (%) Số trâu (+) Tỷ lệ (%) Số trâu có TMT (con) Tỷ lệ (%) Tân Trào 23 4 17,39 4 17,39 4 17,39 Bình Yên 75 8 10,67 8 10,67 8 10,67 Kháng Nhật 69 7 10,14 7 10,14 7 10,14 Tính chung 167 19 11,38 19 11,38 19 11,38 Kết quả bảng 4.1 cho thấy:
- Khi kiểm tra 167 mẫu huyết thanh của trâu tại 3 xã thuộc huyện Sơn Dương bằng Kit tự chế, có 19/167 mẫu huyết thanh dương tính, tỷ lệ nhiễm TMT là 11,38%.
- Tương tự như Kit tự chế, chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng