1.3.3. Đôi nét về cyclodextrin [16].
Cyclodextrin, sản phẩm của quá trình thủy phân starch bằng enzyme. Cyclodextrin lần đầu tiên được miêu tả bởi Villiersnăm 1891. Schardinger lần đầu
tiên đã xuất bản bài báo nói vềα và β-CD vào năm 1903. Trong những năm 1928-
1932 người ta đã phát hiện ra khả năng tạo phức của cyclodexrin với các hợp chất hữu cơ. Năm 1935 Freudenberg and Jacobi đã phát hiện ra γ-CD. Từ những năm
1938-1952 cấu trúc hóa học của α-,β- và γ-CD đã được làm sáng tỏ bởi
Freudenberg, Cramer, Borchert, French and Rundle. Năm 1954, Carmer đã miêu tả cấu trúc hóa học và tính chất hóa lý của α-,β- và γ-CD như: cấu trúc hóa học kích
thước lỗ trống, độ hòa tan, khả năng tạo phức, ảnh hưởng đến độ bền hóa học của
dược chất ít tan. Từ khi phát hiện tới hiện nay CD đã được nghiên cứu phát triển tổng hợp và đã được đưa vào ứng dụng khá phổ biến trong nhiều lĩnh vực.
1.3.4. Cấu trúc phân tử và phân loại CD.
1.3.2.1. Cấu trúc phân tử [5].
CD được sản xuất từ sự thoái hóa một phần tinh bột dưới tác dụng của enzyme. CD là các oligosaccharid bao gồm các phân tử α-D-glucopyranose liên kiết với nhau qua liên kết α-1,4-glycosid.Được cấu tạo như một hình nón cụt với bên trong là phần kỵ nước và bên ngoài là phần ưa nước. Phần bên trong là các phân tử
carbon của phân tửđường kỵnước, phần bên ngoài là các nhóm hydroxyl linh động
thân nước.
Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của các cyclodextrin.
Trong tự nhiên CD căn cứ vào số lượng phân tử đường liên kết tạo thành các vòng thì được chia làm ba loại như sau:
α-cyclodextrin: gồm sáu phân tử glucopyranose.
β-cyclodextrin: gồm bảy phân tử glucopyranose.
γ-cyclodextrin: gồm tám phân tử glucopyranose.
Các nhóm hydroxyl linh hoạt 6-OH cũng có khả năng hình thành các liên kết hydro xung quanh mép dưới cùng nhưng không ổđịnh do ảnh hưởng lưỡng cực, dễ
dàng bị phân ly trong dung dịch và nước, không thấy trong các tinh thể cyclodextrin Các liên kết hydro 3-OH (nhóm cho electron), 2-OH (nhóm nhận electron) trong α- CD, ngược lại 3-OH (nhóm nhận electron), 2-OH (nhóm cho electron), trong β-CD và γ-CD.[12]
Hình 1.12. Cơ chế tạo phức của cylcodextrin
Với cấu trúc phân tử CD có hình thể hình nón cụt. Bên trong thì rỗng, gồm hai phần, phần vỏ bên ngoài là các nhóm hydro thân nước, phần lõi trống bên trong gồm các phân tử carbon kỵ nước. Do có cấu trúc đặc biệt như thế nên CD có thể
hình thành phức hợp với chất phân tích.
1.3.3. Ứng dụng [16].
Đến cuối những năm 1960 hầu hết các công trình nghiên cứu ứng dụng CD và các dẫn chất của nó được thực hiện ở châu Âu. Trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và các ngành khác:
Được sử dụng cho độổn định của hương liệu, giảm bớt mùi hôi khó chịu của các chất gây mùi. Ở Nhật Bản trong những năm 1980 thì lượng CD sản xuất ra thì có tới 80% dành cho công nghiệp thực phẩm. Do họ coi CD là một oligosaccharide tự
nhiên có nguồn gốc từ tinh bột nên không độc hại, chất che dấu mùi của thực phẩm
tươi sống, chất ổn định dầu cá …, bản thân CD cũng là chất làm ngọt có nhiều ưu điểm.
Trong mỹ phẩm
Vào đầu những năm 1970 ởchâu Âu CD được thử nghiệm cho tính ổn định của các hợp chất của các chất hóa học không ổn định để có tác dụng kéo dài, giảm mùi hôi khó chịu. Trong những năm 1990, Procter & Gamble, một công ty Hoa Kỳ dựa
trên, đưa ra nước xả vải có chứa CD để làm tăng thời gian lưu hương trên quần áo.
Do đó nó có được ứng dụng vào trong nước hoa, bột giặt, nước xả.
Trong công nghiệp dược phẩm
Trong công nghệdược phẩm thì CD được ứng dụng rất rộng rãi. Được chia làm nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong sản xuất dược phẩm thì các CD được ứng dụng vào tăng tốc độ hòa tan,
làm tăng tính ổn định của dược chất, hoặc làm giảm kích ứng của các dược chất gây kích ứng.
Trong kiểm nghiệm dược phẩm thì các CD được ứng dụng làm chiral dùng để tách, định tính và định lượng các đồng phân quang học trong kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc trong điện di mao quản.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.1.Nguyên liệu và thiết bị
1.1.1. Chất chuẩn làm việc
Chất chuẩn quốc gia của VIỆN KIỂM NGHIỆM-BỘ Y TẾ:
PROMETHAZIN.HCl; 200 mg/lọ; hàm lượng theo HPLC 99,65% (tính theo khối
lượng khan); Độẩm 0,13%; SKS 0204085. Bảo quản ở 5oC tránh ánh sáng.
1.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Siro Phenergan của công ty sanofi-aventis Việt Nam: chứa Promethazin.HCl
0,1%. SĐK/VISA: VD-12044-10. Số lô SX/Lot:1091111. HD/Exp: 04/12/14.
1.1.3. Hóa chất:
Các hóa chất sử dụng đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết hóa phân tích: - Acid orthophosphoric 85%: Hãng MERCK. Sản xuất tại Đức. - Natritetraborat.10H2O: Hãng MERCK. Sản xuất tại Đức. - Natri hydroxyd (NaOH): Hãng MERCK. Sản xuất tại Đức. - β-cyclodextrin (C42H70O35): Hãng MERCK. Sản xuất tại Đức. - Nước loại ion: nước cất hai lần và được lọc qua máy lọc đề ion.
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị.
- Máy điện di mao quản Agilent CE system 9001và được điều khiển bằng phần mềm Chemstation 100001 (cài trên máy tính Hewlett Packard, Đức) của bộ
môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại Học Dược Hà Nội.
- Cân phân tích Sartorius TE214S.
- Cân kỹ thuật Sarturius TE 412.
-Máy đo pH EUTECH Instrument.
- Máy cất nước hai lần HAMILTON.
- Máy lọc nước đềion MAXIMA ultra pure water.
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60 H.
- Màng lọc cellulose acetat với kích thước lỗ lọc 0,45µm. Hãng Sartorius. Sản xuất tại Đức.
- Các dụng cụ chính xác: các loại bình đựng mức, các loại pipet chính xác với các thể tích khác nhau.
- Các dụng khác; cốc có mỏ,pipet, đũa thủy tinh, máy khuấy từ.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu
2.2.1.1. Pha dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính một lượng cân xác khoảng 10,05mg Promethazin.HCl chuẩn cho vào cốc có mỏ thêm khoảng 30ml nước loạiion đem
siêu âm cho tan hoàn toàn sau đó cho vào bình định mức 50ml, tráng cốc,định mức vừa đủ 50ml bằng nước loại ion và lắc điều. Lọc qua màng lọc cellulose acetat với
kích thước lỗ lọc 0,45µm.
- Các dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 1ml; 2ml; 3ml; 4ml; dung dịch gốc chuẩn pha vào các bình định mức 10ml, thêm nước loại ionvừa đủ và lắc đều. Từ bình 60µg/ml hút chính xác 5ml pha loãng vào bình định mức 10ml.Lọc qua màng lọc 0,2µm.
2.2.1.2. Pha dung dịch thử
- Siro Phenergan: từ lọ siro hút chính xác 1ml bằng pipet chính xác pha vào bình
định mức 25ml, thêm nước loạiion vừa đủ thể tích, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,2µm.
2.2.1.3.Pha dung dịch điện ly nền.
Dung dịch điện ly nền Na2B4O7 40mM: Cân khoảng 0,38 g Na2B4O7.10H2O pha vào bình định mức 25ml, lọc qua màng lọc 0,45µm.
Pha dung dịch acid phosphoric 1M: Hút khoảng 6,8mldung dịch acid orthophosphoric 85% (kl/kl) vào cốc có mỏ và pha loãng với 50ml nước cất cho bình định mức 100ml, bổsung nước vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm. - Pha dung dịch acid phosphoric 100mM: Hút 10ml từ bình acid phosphoric 1M và
pha loãng trong bình định mức 100ml, lọc qua màng lọc 0,45µm.
- Dung dịch điện ly nền acid phosphoric 50mM: lấy 50ml từ bình acid phosphoric 100mM và pha loãng trong bình định mức 100ml, lọc qua màng lọc
0,45µm, trước khi đặt lọ dung dịch điện ly nền vào khay chạy mẫu thì được lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Điều chỉnh pH của các dung dịch điện ly bằng dung dịch NaOH 1M trên
máy đo pH.
2.2.1.4. Pha dung dịch với nồng độ 1M và 0,1M
Pha dung dịch NaOH 1M: Cân khoảng 4,00 gam NaOH vào cốc có mỏ hòa tan, cho vào bình định mức 100ml, tráng sạch cốc cho vào bình định mức bổ sung nước loạiion vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm, sau đó lọc qua màng lọc0,2µm.
Pha dung dịch NaOH 0,1M: Hút chính xác 10ml dung dịchNaOH 1M ở trên pha loãng vào bình định mức 100ml, thêm nước loạiion vừa đủ, lắc điều, lọc qua màng lọc 0,45µm, sau đó lọc qua màng lọc 0,2 µm.
2.2.2. Xây dựng phương pháp
2.2.2.1. Điều kiện điện di mao quản
Phương pháp tiến hành dựa trên kỹ thuật điện di mao quản với bộ phận phát hiện detector mảng Diod (DAD). Trong quá trình tiến hành điện di mao quản có một sốđiều kiện được cốđịnh không thay đổi:
- Mao quản silica nung chảy với chiều dài 65cm (chiều dài hiệu dụng 60cm),
đường kính trong 75µm.
- Tiêm mẫu: 50mbar x 5s.
- Nhiệt độtrong cassette được ổn định ở 25oC.
Điều kiện rủa mao quản: Trong quá trình làm điện di lớp silanol của mao quản bị
ion hóa dẫn đến làm thay đổi dòng EOF làm giảm hiệu lực tách. Vậy nên cần quá trình rửa để phục hồi mao quản đảm bảo hiệu lực tách.
- Đối với mao quản mới:
+ Đầu tiên rủa nước loạiion 10 phút.
+ Bước thứ 2 rửa bằng dung dịch NaOH 1M 30 phút. + Bước thứ 3 rửa nước loạiion 15 phút.
+ Bước thứ 4 rửa bằng dung dịchNaOH 0,1M 15 phút. + Bước cuối cùng rửa bằng nước loạiion 15 phút.
- Đối với mao quản chạy ổn định:
+ Đầu ngày: Rửa mao quản 10 phút nước loạiion,chạy 5 phút dung dịchNaOH 0,1M, 10 phút nước loại ion.
+ Giữa hai lần chạy mẫu: Rửa mao quản 2 phút nước loại ion, 1 phút dung dịchNaOH 0,1M,2 phút nước loại ion,3 phút dung dịch điện ly dùng để phân tích.
+ Cuối ngày: Rửa mao quản 10 phút nước loại ion 5 phút dung dịchNaOH 0,1M, 10 phút nước loại ion. Các điều kiện chúng tôi tiến hành khảo sát gồm: - Lựa chọn bước sóng phát hiện. - Lựa chọn dung dịch điện ly nền. - Khảo sát nồng độ, pH dung dịch điện ly nền. - Khảo sát nồng độ chất chọn lọc đối quang β-CD. - Khảo sát điều kiện thế.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát các điều kiện của quá trình điện di:
3.1.1.Lựa chọn các điều kiện dung dịch điện di 3.1.1.1. Lựa chọn bước sóng.
Để lựa chọn bước sóng phát hiện thích hợp, chúng tôi tiến hành quét phổ tìm λmax của hai đồng phân đối quang của promethazin trên máy điện mao quản CE với nồng
độ 40µg/ml, trong dung dịch điện ly nền, trong vùng bước sóng từ 190-600nm. Kết quả thu được cho thấy hai đồng phân đối quang của promethazin có độ hấp thụ cực
đại ở bước sóng 249,0 nm. Vì vậy chúng tôi lựa chọn bước sóng 249nm dùng để
xây dụng quy trình thẩm định hai đồng phân đối quang của promethazin.
Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS trên chuẩn của promethazin racemic với dung dịch
điện ly nền acid phosphoric 50 mM pH = 2,5; [-CD] = 1,0 mM.
3.1.1.2. Bản chất dung dịch điện ly nền
Dung dịch điện ly nền là một điều kiện đóng vai trò quan trọng đến kết quả phân
tích thu được trong điện di mao quản, do bản chất dung dịch điện ly nền sẽ quyết
định sự xuất hiện hay không của dòng điện thẩm (EOF), cường độ EOF cũng như
mức độ ion hóa của chất cần phân tích, từ đó ảnh hưởng lớn đến mức độtương tác của các đồng phân đối quang của chất cần phân tích với tác nhân chọn lọc đối quang và cả mức độ chọn lọc của tác nhân chọn lọc đối quang với những đồng phân
đối quang kểtrên. Trong điều kiện vật chất và thời gian có được để thực hiện khóa luận này, chúng tôi đã tiến hành thửsơ bộ trên hai dung dịch điện ly nền được dùng phổ biến với hiệu quả cao trong điện di mao quản là dung dịch natri tetraborat và
dung dịch acid phosphoric. Những khảo sát sơ bộ cho thấy khi sử dụng - cyclodextrin (-CD) làm chất chọn lọc đối quang, với dung dịch natri tetraborat, chúng tôi không thể tìm được điều kiện cho phép phân biệt được hai đồng phân đối quang của promethazin (Hình 3.2), trong khi đó acid phosphoric cho phép tách riêng được hai đồng phân này (như sẽ được minh chứng rõ trong các phần tối ưu hóa các điều kiện phân tích khác được trình bày ở các phần tiếp theo). Từ kết quảsơ
bộ kểtrên, chúng tôi đã lựa chọn dung dịch acid phosphoric làm dung dịch điện ly nền để thực hiện tối ưu hóa các điều kiện điện di khác, nhằm hướng tới thiết lập một quy trình phân tích hai đồng phân đối quang của promethazin.
Hình 3.2. Kết quả phân tích trên chuẩn promethazin racemic với dung dịch điện ly nền natri tetraborat 40 mM pH = 9,5 (Điện thế 10 kV, [-CD] = 1,0 mM).
Hình 3.3. Kết quả phân tích trên chuẩn promethazin racemic với dung dịch điện ly nền acid phosphoric 50 mM pH = 2,5 (Điện thế 10 kV, [-CD] = 1,0 mM)
3.1.1.3. Nồng độ, pH dung dịch điện ly nền
Do bản chất đối tượng phân tích của chúng tôi là hai đồng phân đối quang của promethazin, nên chỉ những nhân tốtác động đến tương tác giữa các đồng phân này với chất chọn lọc đối quang (-CD) mới có ảnh hưởng đến độ phân giải của kết quả
tách. Chính vì vậy, do nồng độ dung dịch điện ly nền không có tác động trực tiếp
đến độ phân giải giữa 2 đồng phân đối quang của promethazin, chúng tôi quyết định duy trì nồng độ acid phosphoric sử dụng hằng định trong quá trình khảo sát, xây dựng phương pháp ở mức 50 mM là mức nồng độ cho cường độ dòng hợp lý khi phân tích (khoảng 40 - 70 A ở mức thế 15 kV). Ngược lại, pH dung dịch điện ly nền là yếu tố có ảnh hưởng đến độ phân giải, nên chúng tôi đã tiến hành khảo sát
ảnh hưởng của pH bằng cách cố định nồng độ-CD và các điều kiện điện di khác, rồi tiến hành phân tích chuẩn promethazin racemic ở nhiều pH khác nhau của dung dịch acid phosphoric 50 mM. Do kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy khi pH dung dịch
điện ly nền ở vùng acid, kết quả tách hai đồng phân đối quang của promethazin sẽ
tốt hơn nhiều so với khi phân tích ở vùng pH kiềm (như với natri tetraborat, phần 3.1.1.2), chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát ảnh hưởng thay đổi pH của dung dịch acid phosphoric 50 mM trong vùng acid, cụ thể là từ khoảng 2,0 đến 3,6. Kết quả cho thấy, độ phân giải tăng nhẹ khi chỉnh pH từ 2,0 (Rs = 1,45) lên 2,5 (Rs = 1,54).
Song khi tăng tiếp pH từ2,5 đến 3,6, độ phân giải giữa hai đồng phân đối quang của promethazin giảm dần, hai pic của hai đồng phân này không còn được tách hoàn toàn khi pH tăng lên (Hình 3.4). Như vậy, pH = 2,5 đem lại kết quả tách tốt nhất giữa hai đồng phân đối quang của promethazin.Vì vậy dung dịch điện ly nền chúng tôi sử dụng cho quy trình là acid phosphoric 50 mM pH = 2,5.
Hình 3.4. Kết quả phân tích trên chuẩn promethazin racemic với dung dịch điện ly nền acid phosphoric 50 mM với các pH khác nhau
(Điện thế 10 kV, [-CD]= 1,0 mM). 3.1.1.4. Khảo sát nồng độ chất chọn lọc đối quang -CD. pH = 2,0 pH = 3,0 pH = 3,6 pH = 2,5
Sau khi cố định dung dịch điện ly nền là acid phosphoric 50 mM pH = 2,5, chúng tôi đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của nồng độ-CD tới khảnăng tách hai đồng phân đối quang của promethazin. Do đặc điểm hạn chế đặc trưng của -CD là
độ hòa tan hạn chế trong nước, khoảng nồng độ chúng tôi tiến hành khảo sát dao
động trong khoảng từ 0,5 mM đến 5,0 mM, ở mức nồng độ cao hơn nữa, -CD bắt
đầu có hiện tượng tủa dần trở lại theo thời gian dẫn tới nguy cơ làm tắc mao quản.
Ở mức nồng độ -CD là 0,5 mM, hai đồng phân đối quang của promethazin được phân biệt tương đối rõ, tuy nhiên vẫn chưa được tách hoàn toàn (hình 3.5).Khi nồng
độ -CD được nâng lên đến 1,0 mM, hai đồng phân đối quang của promethazin đã
được tách hoàn toàn với độ phân giải Rs = 1,52 (hình 3.6), độ phân giải được cải