3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (GA3, BA, NAA) đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe)
-Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 kết hợp với BA đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 kết hợp với NAA đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá.
3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin) đến khả năng nhân nhanh của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Gừng Núi Đá.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Gừng Núi Đá.
3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (NAA, BA) đến khả năng ra rễ của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây Gừng Núi Đá. - Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với BA đến khả năng ra rễ của cây Gừng Núi Đá.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp tạo vật liệu vô trùng
Phương pháp vô trùng mẫu được tiến hành dựa trên phương pháp vô trùng trong nuôi cấy in vitro một số loại cây thuộc chi Zingiber, có cải tiến để phù hợp với đối tượng và điều kiện của phòng thí nghiệm [32], [38], [41], [44].
Các bước tiến hành vô trùng mẫu như sau:
- Mẫu lấy là các mầm ngủ của thân rễ (củ) cây Gừng Núi Đá, mẫu sau khi cắt được rửa sạch dưới vòi nước, loại bỏ bớt phần đất bẩn, phần thừa, dùng xà phòng loãng để rửa, sau đó tráng lại bằng nước cất.
- Khử trùng mẫu: Tiến hành trong box cấy vô trùng, khử trùng bằng cồn 70o
trong 30-45 giây, tráng lại 3-5 lần bằng nước cất vô trùng; sau đó, khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% trong 5-7 phút, tráng lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng. Đặt mẫu lên giấy thấm và để khô tự nhiên trong box.
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (GA3, BA, NAA) đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe)
- Sử dụng môi trường nền là môi trường khoáng đa lượng, vi lượng + vitamin là thành phần của môi trường MS + đường 20 g/l + agar 5 g/l, pH = 5,6-5,8.
- Môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng với nồng độ khác nhau trong từng thí nghiệm.
- Mẫu sau khi khử trùng được đưa vào môi trường nuôi cấy bề mặt, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ phòng từ 22-25oC, độ ẩm 60-65%, chu kỳ chiếu sáng 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi, quan sát số chồi tái sinh và chất lượng chồi sau 20 ngày.
3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm có 5 công thức (CT), mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 1 mẫu.
CT 1 (Đ/c): MT nền + GA3 0,0 mg/l CT 2: MT nền + GA3 0,3 mg/l CT 3: MT nền + GA3 0,5 mg/l CT 4: MT nền + GA3 1,0 mg/l CT 5: MT nền + GA3 2,0 mg/l
Nồng độ GA3 thích hợp nhất cho tái sinh chồi đã xác định ở thí nghiệm 1 (ký hiệu là A) được sử dụng cho thí nghiệm sau.
3.4.2.1. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 kết hợp với BA đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá
- Bố trí thí nghiệm: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm có 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 1 mẫu.
Sử dụng MT nền + A (nồng độ GA3 thích hợp nhất cho tái sinh chồi đã xác định ở thí nghiệm 1).
CT 1 (Đ/c): MT nền + A + BA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + BA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + A + BA 1,0 mg/l CT 4: MT nền + A + BA 2,0 mg/l
3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 kết hợp với NAA đến khả
năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm có 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 1 mẫu.
Sử dụng MT nền + A (nồng độ GA3 thích hợp nhất cho tái sinh chồi đã xác định ở thí nghiệm 1).
CT 1 (Đ/c): MT nền + A + NAA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + NAA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + A + NAA 1,0 mg/l CT 4: MT nền + A + NAA 2,0 mg/l
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin) đến khả năng nhân nhanh của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe)
- Chồi đã tái sinh đạt chiều dài từ 1-2 cm sẽ được tách riêng và chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền, có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin) để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.
- Sử dụng lưỡi dao số 11 đã khử trùng để tách những chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt và dùng pank đã khử trùng cấy chuyển chồi sang môi trường nhân nhanh. Sau đó đưa vào phòng nuôi.
- Theo dõi và quan sát số chồi tạo thành ở mỗi mẫu và chất lượng chồi sau 40 ngày.
3.4.3.1. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Gừng Núi Đá
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm có 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 1 mẫu.
CT 1 (Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + BA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + BA 1,0 mg/l CT 4: MT nền + BA 2,0 mg/l CT 5: MT nền + BA 4,0 mg/l
3.4.3.2. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Gừng Núi Đá
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm có 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 1 mẫu.
CT 1 (Đ/c): MT nền + Kinetin 0,0 mg/l CT 2: MT nền + Kinetin 0,3 mg/l CT 3: MT nền + Kinetin 0,5 mg/l CT 4: MT nền + Kinetin 1,0 mg/l CT 5: MT nền + Kinetin 2,0 mg/l
3.4.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (NAA, BA) đến khả năng ra rễ của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe)
- Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì tiến hành cấy chuyển sang môi trường ra rễ có: MT nền, bổ sung chất kích thích sinh trưởng (NAA, BA) để theo dõi khả năng tạo rễ của mẫu.
- Đưa mẫu vào phòng nuôi cấy. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ sau 30 ngày.
3.4.4.1. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây Gừng Núi Đá.
Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm có 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 1 mẫu.
CT 1 (Đ/c): MT nền + NAA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + NAA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + NAA 1,0 mg/l CT 4: MT nền + NAA 1,5 mg/l CT 5: MT nền + NAA 2,0 mg/l
Nồng độ thích hợp nhất cho ra rễ đã được xác định ở thí nghiệm 6 được sử dụng cho thí nghiệm sau (kí hiệu là B).
3.4.4.2. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với BA đến khả
năng ra rễ của cây Gừng Núi Đá. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm có 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 1 mẫu.
Sử dụng môi trường nền + B (nồng độ thích hợp nhất cho ra rễ đã được xác định ở thí nghiệm 6)
CT 1 (Đ/c): MT nền + B + BA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + B + BA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + B + BA 1,0 mg/l CT 4: MT nền + B + BA 2,0 mg/l
3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu
Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được tính toán theo các công thức sau:
Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu) × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi thu được (chồi) Tổng số chồi đưa vào (chồi)
Tỷ lệ mẫu ra rễ (%) = Tổng sỗ mẫu ra rễ (mẫu)
× 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
Chất lượng chồi:
- Chồi tốt: Chồi khỏe, mập, xanh
- Chồi trung bình: Chồi khỏe, màu xanh - Chồi kém: Chồi yếu, nhỏ.
Chất lượng rễ:
- Rễ tốt: Rễ dài, nhiều lông hút
- Rễ trung bình: Rễ ngắn, nhiều lông hút - Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ, ít lông hút
Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học bằng phần mềm Microsoft office Excel 2003 và phần mềm IRRISTAT 5.0.
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá
4.1.1. Kết quả ảnh hưởng của GA3 đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe)
Gibberellin là một trong những nhóm hoocmon quan trọng của thực vật và thuộc nhóm chất kích thích sinh trưởng. Hiện nay đã phát hiện khoảng 60 loại gibberellin, kí hiệu từ GA1 đến GA60, trong đó GA3 có hoạt tính sinh học mạnh nhất và thường dùng trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Mẫu đã khử trùng được đưa vào môi trường có bổ sung GA3 với các nồng độ khác nhau, sau đó theo dõi khả năng tái sinh chồi của mẫu trong vòng 20 ngày. Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quảảnh hưởng của GA3đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá (sau 20 ngày)
Công thức Nồng độ GA3 (mg/l) Số mẫu nuôi cấy (mẫu) Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu) Tỷ lệ tái sinh (%) Chất lượng chồi CT 1 (Đ/c) 0,0 30 15 50,00 Chồi kém CT 2 0,3 30 18 60,00 Chồi trung bình CT 3 0,5 30 25 83,33 Chồi tốt CT 4 1,0 30 17 56,67 Chồi tốt CT 5 2,0 30 21 70,00 Chồi trung bình CV% 5,30 LSD.05 6,16
Nồng độ GA3 0,5 mg/l cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất (88,33%), chất lượng chồi tốt. CT đối chứng cho tỷ lệ tái sinh thấp nhất (50%), chất lượng chồi trung bình. Nồng độ 0,3 mg/l, 1,0 mg/l, 2,0 mg/l cho tỷ lệ lần lượt là 60%, 56,67% và 70%.
Chồi tốt: Chồi khỏe, mập, xanh; Chồi trung bình: Chồi khỏe, màu xanh; Chồi kém: Chồi yếu, nhỏ.
Từ bảng 4.1 nhận thấy: Với giá trị LSD = 6,16 thì các công thức thí nghiệm khác nhau đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy là 95%.
Hình 4.1. Ảnh hưởng của GA3đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá (sau 20 ngày)
CT 1 (Nồng độ GA3 0,0 mg/l) cho tỷ lệ
tái sinh chồi thấp nhất 50%, chồi chất lượng kém
CT 2 (Nồng độ GA3 0,3 mg/l) cho tỷ lệ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tái sinh chồi đạt 60%, chồi chất lượng trung bình, xanh
CT 3 (Nồng độ GA3 0,5 mg/l) cho tỷ lệ
tái sinh chồi cao nhất, đạt 83,33%, chồi xanh, mập
CT 4 (Nồng độ GA3 1,0 mg/l) cho tỷ lệ
tái sinh chồi là 56,67%, chồi chất lượng tốt
CT 5 (Nồng độ GA3 2,0 mg/l) cho tỷ lệ
tái sinh chồi là 70%, chồi chất lượng trung bình
Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy GA3 với nồng độ từ 0-2,0 mg/l thì sau 20 ngày nuôi cấy, tỷ lệ chồi tái sinh từ mẫu ban đầu có giá trị từ 50-83,33%. Trong đó, công thức đối chứng (môi trường nền không bổ sung GA3) cho tỷ lệ tái sinh thấp nhất (50%), chất lượng chồi kém, chồi nhỏ (Hình 4.1).
Khi tăng dần nồng độ GA3 lên 0,3 và 0,5 mg/l thì tỷ lệ tái sinh chồi tăng dần lần lượt có giá trị là 60% và 83,33%, chất lượng chồi cũng cao hơn, từ chồi có chất lượng trung bình (chồi khỏe, xanh nhạt) đến chất lượng tốt (chồi mập, khỏe, xanh tươi). Ở nồng độ 1,0 mg/l thì tỷ lệ tái sinh giảm xuống còn 56,67% nhưng chồi vẫn có chất lượng tốt. Tăng tới nồng độ GA3 2,0 mg/l thì tỷ lệ tái sinh đạt 70% tuy nhiên chất lượng chồi đã giảm, chồi nhỏ, màu kém xanh; các công thức khác nhau cho tỷ lệ tái sinh khác nhau ở mức độ tin cậy 95%. Như vậy, thí nghiệm đã xác định được nồng độ GA3 0,5 mg/l là tốt nhất cho tái sinh chồi ở cây Gừng Núi Đá.
Kết quả trên được giải thích như sau: GA3 là hoocmon thuộc nhóm kích thích sinh trưởng, có tác dụng kích thích sự kéo dài của cành, chồi và phá vỡ trạng thái ngủ của mầm. Do đó, khi đưa GA3 vào môi trường nuôi cấy sẽ kích thích chồi phát triển, tuy nhiên tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất ở nồng độ 0,5 mg/l, khi tăng lên nồng độ cao hơn, tỷ lệ tái sinh chồi giảm. Điều này chứng minh rằng hiệu quả tái sinh chồi phụ thuộc vào yếu tố nội sinh của mẫu, ở nồng độ phù hợp thì GA3 sẽ có hiệu quả tốt trong tái sinh chồi ở cây Gừng Núi Đá, nồng độ quá cao có thể dẫn tới tác dụng ngược, gây độc đối với tế bào, hạn chế tỷ lệ tái sinh cũng như chất lượng chồi.
J. R. Rout và cs (2011) [30], khi nghiên cứu trên đối tượng cây Sâm Ấn Độ, đã thử nghiệm khả năng nảy chồi trong môi trường MS có bổ sung GA3 với các nồng độ khác nhau nhận thấy ở nồng độ GA3 0,25 mg/l sẽ cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất; nồng độ cao hơn (0,5 mg/l) hoặc thấp hơn (0,1 mg/l) cũng đều cho thấy tỷ lệ kém hơn.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi không giống với nghiên cứu trước có thể lý giải là do đối tượng nghiên cứu khác nhau, dẫn tới các yếu tố về mặt nội sinh không giống nhau sẽ cho kết quả khác nhau.
4.1.2. Kết quả ảnh hưởng của GA3 kết hợp với BA đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe)
BA là chất thuộc nhóm cytokinin-nhóm chất kích thích sinh trưởng thường được sử dụng trong nuôi cấy in vitro. Từ nồng độ GA3 tốt nhất cho việc tái sinh chồi cây Gừng Núi Đá đã nghiên cứu ở thí nghiệm 1, tiến hành khảo sát tỷ lệ tái sinh chồi khi kết hợp với BA.
Bảng 4.2. Kết quảảnh hưởng của GA3 kết hợp với BA đến khả năng tái sinh chồi của cây Gừng Núi Đá (sau 20 ngày)
Công thức Nồng độ GA3 (mg/l) Nồng độ BA (mg/l) Số mẫu nuôi cấy (mẫu) Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu) Tỷ lệ tái sinh (%) Chất lượng chồi CT1(Đ/c) 0,5 0,0 30 20 66,67 Chồi trung bình CT 2 0,5 30 21 70,00 Chồi tốt CT 3 1,0 30 28 93,33 Chồi tốt CT 4 2,0 30 24 80,00 Chồi tốt CV% 4,20 LSD.05 6,07
Môi trường có nồng độ GA3 0,5 mg/l + BA 1,0 mg/l cho hiệu quá tái sinh chồi cao nhất đạt 93,33% tổng số mẫu đưa vào, chất lượng chồi tốt. Tỷ lệ tái sinh khá cao ở công thức có BA 2,0 mg/l với 80%, chồi mập, xanh tươi. Tiếp đó là BA 0,5 mg/l là 70,0% và đối chứng cho tỷ lệ tái sinh thấp nhất (66,67%).
Chồi tốt: Chồi khỏe, mập, xanh; Chồi trung bình: Chồi khỏe, màu xanh; Chồi kém: Chồi yếu, nhỏ.
Kết quả thu được sau khi nuôi cấy trong môi trường bổ sung GA3 0,5 mg/l và có mặt BA với các nồng độ từ 0-2,0 mg/l đã thể hiện: Tỷ lệ tái sinh dao động từ 66,67% đến 93,33%. Nồng độ BA từ 0-1,0 mg/l thì tỷ lệ tái sinh chồi tăng rõ rệt