2.2.3.1. Thử độc tớnh cấp: [15], [55], [59].
Phƣơng phỏp:
64 chuột BALB/c khoẻ mạnh, khối lƣợng 26±2 g, khụng phõn biệt giống, nuụi tại khu nuụi động vật của Viện Cụng nghệ Sinh học, đƣợc chia làm 8 lụ (8 chuột/lụ), và bị bỏ đúi hoàn toàn 16 h trƣớc khi cho uống cao dịch chiết ethyl acetat Mỏn đỉa một lần duy nhất ở cỏc ở nồng độ 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000 và 12000 mg/kg thể trọng (kgP) tƣơng ứng với 8 lụ thớ nghiệm. Sau khi cho uống 1-2 giờ, chuột đƣợc nuụi dƣỡng bỡnh thƣờng trở lại (cho ăn, uống tự do) và theo dừi liờn tục trong 72 giờ để xỏc định số chuột chết trong từng lụ và tớnh giỏ trị LD50 theo cụng thức của Abraham (1978) và Turner (1965).
Cụng thức tớnh giỏ trị LD50 k-1
LD50 = Xk - d/2 - d/n x mi i=2
Trong đú: LD50: liều chết 50% động vật thớ nghiệm n: số động vật sử dụng trong từng lụ thớ nghiệm
21
k: số lụ động vật
mi: số động vật chết đếm theo từng lụ trong 72 giờ d: khoảng cỏch giữa cỏc mức liều
Xk: liều thuốc thấp nhất gõy chết 100% động vật thớ nghiệm
2.2.3.2. Thử tỏc dụng chống oxy húa invitro [19], [20], [26], [27].
Phương phỏp phõn lập trực tiếp tế bào gan chuột: Chuột BALB/c khoẻ mạnh đƣợc sử dụng để tỏch tế bào gan. Gõy chết chuột bằng ether, tỏch lấy gan. Gan chuột sau khi tỏch đƣợc rửa bằng PBS cú 10% khỏng sinh PSF (Penicillin-Streptomicin-Fungizone) (Invitrogen) sau đú dựng panh, kộo, kim tiờm gạt, tỏch tế bào gan trong PBS. Thu dịch cú tế bào gan, li tõm, loại bỏ dịch nổi. Cặn tế bào đƣợc hoà trong NH4Cl để phỏ vỡ hồng cầu. Sau khi li tõm cắn tế bào thu đƣợc hoà lại vào mụi trƣờng MEME cú 10% FBS.
Phộp thử sinh học kiểm tra khả năng chống oxy hoỏ của hoạt chất trờn tế bào gan.
Nguyờn lớ phộp thử: H2O2 khụng những là một gốc tự do phổ biến mà cũn là một chất chuyển hoỏ thƣờng xuyờn xuất hiện ở trong cỏc tế bào động vật, đƣợc tạo ra do cỏc phản ứng khử oxy sinh học. Tuy nhiờn, H2O2 cũng là nguyờn nhõn gõy ra sự hỡnh thành cỏc gốc tự do nội sinh khỏc (vớ dụ nhƣ HO.
) thụng qua cỏc phản ứng oxy hoỏ khử khỏc nhau trong tế bào và điều đú ảnh hƣởng nghiờm trọng tới sự sống cũn của tế bào. Để kiểm chứng khả năng bảo vệ tế bào trƣớc cỏc tỏc nhõn oxy hoỏ và cỏc gốc tự do của cỏc hoạt chất tiềm năng, cỏc nhà nghiờn cứu đó sử dụng tế bào gan làm mụ hỡnh nghiờn cứu. Trong đú, tế bào gan với cỏc hệ enzyme khử độc nhƣ glutathione S- transferases (GSTs), NAD(P)H:(quinone-acceptor) oxydoreductase (QR) v.v. luụn là cơ quan thải độc cho cơ thể, sẽ bị H2O2 tỏc động trực tiếp và hoạt chất cần kiểm tra sẽ đƣợc đƣa vào nhƣ chất bảo vệ. Nếu hoạt chất cú thể bảo vệ tế bào gan khỏi tỏc động của H2O2 sẽ đƣợc xem là cú hoạt tớnh chống oxy hoỏ.
22
Nội dung của phộp thử sinh học:
Tế bào gan từ gan chuột sau khi phõn lập đƣợc nuụi ổn định 1-2 ngày, sau đú đƣa vào đĩa thớ nghiệm 96 giếng với mật độ 1 x 104
tb/giếng để nuụi qua đờm trong tủ ấm 5% CO2, ở 37o
C.
Thờm chất nghiờn cứu hoặc Curcumin (đối chứng dƣơng) ở cỏc nồng độ khỏc nhau, ủ trong 2h.
Thờm 100 M H2O2 vào mỗi giếng và để tỏc động trong 2h.
Để xỏc định số tế bào gan sống sút sau tỏc động của H2O2 cũng nhƣ tỏc động bảo vệ của hoạt chất nghiờn cứu, MTT nồng độ 1mg/ml (50 l/giếng) sẽ đƣợc đƣa vào cỏc giếng và ủ tiếp trong 4h ở 37o
C.
Loại bỏ toàn bộ dịch nổi và đƣa vào mỗi giếng 100 l/giếng DMSO 100% Đo mật độ quang học (giỏ trị OD – Optical Density) của chất formazan tạo thành bằng mỏy Microplate Reader ở 492 nm.
Tất cả thớ nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần để trỏnh sai số.
Cỏc số liệu đƣợc xử lớ bằng phần mềm TableCurve 2D phiờn bản số 4 và EXEL để tớnh giỏ trị Standard Deviation. Độ chớnh xỏc của số liệu đƣợc tớnh bằng R2. Nếu R2 ≥ 0,95 thỡ kết quả đƣợc xem là đỏng tin cậy với sai số P ≤ 0,05
% tế bào gan sống sút = [OD(chất thử) - OD(H2O2)] x 100 OD(Tế bào) - OD(H2O2)
Trong đú:
OD(chất thử), OD(H2O2), OD(Tế bào) lần lƣợt là giỏ trị mật độ quang học đo ở giếng cú chất cần kiểm tra hoạt tớnh, ở giếng đối chứng õm (chỉ gõy chết tế bào bằng H2O2) và ở giếng mà tế bào hoàn toàn khỏe mạnh, khụng bị gõy chết bằng H2O2
23 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.3.3. Thử tỏc dụng bảo vệ gan, tỏc dụng chống oxy húa invivo
a. Nguyờn tắc:
- Gõy viờm gan chuột nhắt trắng bằng paracetamol. Paracetamol gõy độc đối với tế bào gan, đặc biệt là khi dựng liều cao. Hợp chất này đƣợc chuyển húa bởi cytochrom P450 tạo ra chất chuyển húa độc hại là N-acetyl-p- benzoquinone imine (NAPQI). Paracetanol làm thỏo rỗng GSH và liờn kết đồng húa trị NAPQI với phần cystein cũn lại trờn protein làm sản sinh cỏc sản phẩm 3-(cysteine-S-yl) APAP (N-acetyl- p- aminophenol) gõy hoại tử tế bào gan và kết quả là làm tăng men gan. Định lƣợng men gan để đỏnh giỏ tỏc dụng của mẫu thử [10], [23].
b. Cỏch tiến hành:
Gõy tổn thƣơng gan bằng paracetamol (PAR) với liều 400 mg/kg, paracetamol đƣợc pha trong dung dịch dung dịch sinh lớ với nồng độ 50 mg/ml. 36 chuột BALB/c cú khối lƣợng 26 g ± 2 g đƣợc chia làm 6 lụ (6 con/lụ)
- Lụ 1: uống DMSO 10%: 0,2 ml/con/ngày (chuột khỏe mạnh bỡnh thƣờng).
- Lụ 2: uống DMSO 10%: + Paracetamol (bệnh lý)
- Lụ 3, 4, 5: uống cao chiết ethyl acetat liều lần lƣợt là 500 mg/kg/ngày, 1000 mg/kg/ngày, 2000 mg/kg/ngày.
- Lụ 6: uống Silymarin 50 mg/kg/ngày (chứng dƣơng)
Chuột ở tất cả cỏc lụ đƣợc uống cao chiết và thuốc cần nghiờn cứu liờn tục 7 ngày trƣớc và 2 ngày sau khi gõy độc cho gan, mỗi ngày cho uống 1 lần vào buổi sỏng. Ngày thứ 7 sau uống mẫu 1 giờ, nhịn đúi 14-16 giờ trƣớc đú, gõy độc gan bằng cỏch cho uống paracetamol (chỉ cho cỏc lụ 2, 3, 4, 5) với liều paracetamol 400 mg/kg/1 lần duy nhất.
24
Sau 48 giờ uống paracetamol, lấy mỏu định lƣợng aminotransferase (AST, ALT), cõn khối lƣợng gan, quan sỏt đại thể gan và xỏc định hàm lƣợng MDA trong gan.
Định lượng aminotransferase
Định lƣợng aminotransferase (AST, ALT) trong huyết thanh chuột đƣợc định lƣợng bằng phƣơng phỏp so màu, thực hiện trờn mỏy định lƣợng sinh hoỏ bỏn tự động AU680 của hóng Beckman Coulter.
Kiểm tra trực quan gan
Sau toàn bộ thớ nghiệm và sau khi lấy mỏu xột nghiệm, chuột đƣợc mổ để kiểm tra trực quan. Chụp ảnh gan động vật thớ nghiệm.
Xỏc định hàm lượng MDA trong gan
Tỏch gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1 : 10 (gan : dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 – 50C. Lấy 2 ml dịch đồng thể, thờm vào 1 ml dung dịch đệm Tris - HCl, ủ ở 370C trong 1 giờ. Kết thỳc phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%, ly tõm 5000 vũng/phỳt trong 5 phỳt, lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8 % ở 95-1000C trong 15 phỳt và đo màu ở λ = 532 nm.
Tớnh toỏn kết quả: Hàm lƣợng MDA (nM/ml) đƣợc tớnh theo phƣơng trỡnh hồi qui chất chuẩn MDA: y = 0,0637x - 0,0029 (R2 = 0,9981).
CnMMDA/ml dịch đồng thể = (ODthử + 0,0029)/0,0637. Sau khi tớnh đƣợc hàm lƣợng MDA (nM/ml dịch đồng thể)
Phương phỏp xử lớ số liệu
Cỏc số liệu đƣợc sử lớ trờn Excel, thuật toỏn thống kờ student t’test, F’test và phƣơng phỏp phõn tớch phƣơng sai một nhõn tố ngẫu nhiờn (one way ANOVA) và sử dụng hệ số LSD (least-significant difference) để kiểm tra sự sai khỏc cú ý nghĩa so với đối chứng õm, với đối chứng paracetamol (PAR), với Silymarin. Nếu p<0,05 đƣợc coi là sai khỏc cú ý nghĩa, nếu p>0,05 sự sai khỏc là khụng cú ý nghĩa thống kờ.
25
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU 3.1. NGHIấN CỨU VỀ THỰC VẬT
3.1.1. Đặc điểm vi phẫu
Cỏc đặc điểm vi phẫu lỏ và vi phẫu thõn đƣợc thể hiện ở hỡnh 3.1 và 3.2. Vi phẫu lỏ:
Hỡnh 3.1. Ảnh vi phẫu lỏ Mỏn đỉa 1. Lụng che chở 4. Mụ mềm vỏ 7. Gỗ
2. Biểu bỡ 5. Mụ cứng 8. Mụ giậu
3. Mụ dày 6. Libe 9. Mụ khuyết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phần gõn lỏ: Gõn lỏ lồi ớt ở phớa trờn, lồi nhiều hơn ở phớa dƣới. Từ ngoài vào trong cú: biểu bỡ trờn và dƣới là một hàng tế bào nhỏ. Lớp biểu bỡ mang nhiều lụng che chở. Sỏt biểu bỡ trờn và dƣới là mụ dày, gồm cỏc tế bào hỡnh đa giỏc. Mụ mềm vỏ cấu tạo là cỏc tế bào thành mỏng. Sỏt với mụ mềm vỏ là mụ cứng. Mụ cứng cấu tạo bởi cỏc tế bào cú kớch thƣớc nhỏ, thành dày tạo thành cung lớn bao quanh bú libe-gỗ.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
26
- Phần phiến lỏ: Biểu bỡ ở phiến lỏ giống với ở phần gõn lỏ. Dƣới biểu bỡ là mụ giậu, gồm 1 hàng tế bào hỡnh chữ nhật xếp đứng, vuụng gúc với biểu bỡ trờn. Rải rỏc trong mụ giậu cú cỏc tinh thể canxi oxalat. Trong cựng là mụ khuyết, rải rỏc cú cỏc thể cứng.
Vi phẫu thõn
Hỡnh 3.2. Vi phẫu thõn Mỏn đỉa
Mặt cắt vi phẫu thõn to hỡnh trũn, thõn nhỏ hỡnh đa giỏc. Từ ngoài vào trong cú: lớp biểu bỡ gồm 1 hàng tế bào xếp đều đặn, mang nhiều lụng che chở đa bào. Tiếp theo là mụ mềm vỏ gồm 4-5 lớp tế bào cú thành mỏng, kớch thƣớc to nhỏ khụng đều nhau. Trong mụ mềm vỏ là cỏc tế bào mụ cứng cú thành dày, xếp thành từng đỏm ở ranh giới giữa mụ mềm vỏ và libe. Libe là
Chỳ thớch: 1: Lụng che chở 4: Mụ cứng 7: Mụ mềm ruột 2: Biểu bỡ 5: Libe 3: Mụ mềm vỏ 6: Gỗ 3 4 5 6 7 2 1
27
những tế bào nhỏ, thành mỏng, tạo thành vũng liờn tục. Gỗ gồm cỏc mạch gỗ lớn, xếp thành bú. Trong cựng là mụ mềm ruột gồm cỏc tế bào hỡnh nhiều cạnh, thành mỏng, kớch thƣớc lớn hơn cỏc tế bào mụ mềm vỏ, càng vào trong kớch thƣớc cỏc tế bào càng lớn. Tinh thể canxi oxalat nằm rải rỏc trong mụ mềm vỏ, mụ mềm ruột, gỗ và libe.
3.1.2. Đặc điểm bột
Đặc điểm bột lỏ và bột thõn Mỏn đỉa thể hiện ở hỡnh 3.3 và 3.4. Đặc điểm bột lỏ:
Bột màu lục nhạt, khụng mựi, vị đắng nhạt. Quan sỏt dƣới kớnh hiển vi thấy: mảnh mụ mềm gồm những tế bào đa giỏc, cú thành mỏng (1). Nhiều lụng che chở đa bào (2). Rải rỏc cú sợi đứng riờng lẻ hay tập trung thành bú (3). Nhiều mảnh mạch mạng (4), mạch điểm (5) và mạch xoắn (6). Mảnh phiến lỏ đụi khi thấy lỗ khớ (7) hay lụng che chở (8). Cỏc khối nhựa màu nõu đỏ (9) kớch thƣớc khụng đồng đều. Mảnh bần gồm cỏc tế bào hỡnh chữ nhật hay đa giỏc xếp thành lớp, kớch thƣớc khụng đều nhau (10). Tinh thể Canxi oxalat hỡnh khối đứng riờng rẽ hay tập trung thành từng đỏm (11).
Hỡnh 3.3. Ảnh đặc điểm bột lỏ Mỏn đỉa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
28
Đặc điểm bột thõn:
Bột màu vàng nõu, khụng mựi, vị đắng nhạt. Quan sỏt dƣới kớnh hiển vi thấy: mảnh mụ mềm gồm cỏc tế bào đa giỏc xếp sớt nhau, kớch thƣớc khụng đều (1). Nhiều mảnh mạch mạng (2) và mạch điểm (3). Sợi tập trung thành từng bú (4). Tinh bột hỡnh trũn, cú rốn hỡnh sao rừ, đứng riờng lẽ, kộp đụi hay tập trung thành cụm (5). Mảnh bần gồm cỏc tế bào đa giỏc màu nõu đỏ (6).
Hỡnh 3.4. Ảnh đặc điểm bột thõn Mỏn đỉa
3.2. NGHIấN CỨU VỀ HểA HỌC
3.2.1. Định tớnh cỏc nhúm chất hữu cơ cú trong cõy Mỏn đỉa
Kết quả định tớnh cỏc nhúm chất hữu cơ từ phần trờn mặt đất cõy Mỏn đỉa (Archidendron clypearia (Jack) I. Niels – Mimosaceae) đƣợc trỡnh bày ở bảng 3.1. 1 2 3 4 5 5 6 6
29
Bảng 3.1. Kết quả định tớnh cỏc nhúm chất hữu cơ từ phần trờn mặt đất của cõy Mỏn đỉa STT Nhúm chất Phản ứng định tớnh Kết quả phản ứng Kết quả định tớnh 1 Alcaloid Mayer - Khụng Dragendorff - Bouchadat - 2 Flavonoid Cyanidin ++ Cú NaOH 10% +++ NH3 +++ FeCl3 5% +++ 3 Glycosid tim Liebermann ++ Khụng Baljet - Legal - 4 Coumarin Mở, đúng vũng lacton + Cú Vi thăng hoa + Diazo +
5 Saponin Hiện tƣợng tạo bọt +
Cú Hiện tƣợng phỏ huyết + 6 Anthranoid Borntraeger - Khụng 7 Tanin FeCl3 5% + Cú Cu(CH3COO)2 10% + gelatin 2% +
8 Acid hữu cơ Na2CO3 +++ Cú
9 Đƣờng khử TT Fehling ++ Cú (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
10 Chất bộo Tạo vết mờ trờn giấy + Cú
11 Acid amin Ninhydrin 3% - Khụng
12 Sterol Liebermann ++ Cú
Ghi chỳ: (-): Phản ứng õm tớnh (++) : Phản ứng dƣơng tớnh rừ (+): Phản ứng dƣơng tớnh (+++): Phản ứng dƣơng tớnh rất rừ
30
Nhận xột: Qua cỏc phản ứng định tớnh húa học đặc trƣng đó xỏc định trong phần trờn mặt đất của cõy Mỏn đỉa cú flavonoid, acid hữu cơ, sterol, tanin, coumarin, saponin, đƣờng khử và chất bộo. Trong đú flavonoid, sterol và acid hữu cơ là 3 nhúm chớnh với phản ứng dƣơng tớnh rừ.
3.2.2. Chiết xuất và phõn lập cỏc hợp chất
Phần trờn mặt đất của cõy Mỏn đỉa đƣợc rửa sạch, sấy khụ ở 50 -60ºC, xay thành bột thụ và tiến hành chiết xuất, phõn lập cỏc hợp chất.
3.2.2.1. Chiết xuất
- Chiết xuất cao toàn phần:
Bột dƣợc liệu khối lƣợng 5,0 kg đƣợc ngõm ở nhiệt độ phũng bằng methanol tuyệt đối, chiết 3 đợt, mỗi đợt 1 tuần. Dịch chiết thu đƣợc đem cụ quay hỳt chõn khụng ở 50oC thu đƣợc cắn dạng cao đặc.
- Tạo dịch chiết cỏc phõn đoạn:
Tiến hành chiết phõn đoạn với cỏc dung mụi cú độ phõn cực tăng dần lần lƣợt là n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-butanol. Phõn tỏn cắn toàn phần trong 3l nƣớc, sau đú thờm 3l n-hexan, khuấy đều rồi chia hỗn hợp ra 3 bỡnh gạn dung tớch 2l. Tiến hành lắc bỡnh gạn để gạn lấy lớp n-hexan. Lớp dịch nƣớc cũn lại đƣợc cho thờm 3l n-hexan và tiến hành lắc bỡnh gạn để lấy lớp n-hexan nhƣ trờn thờm 2 lần nữa. Cỏc dung mụi hữu cơ cũn lại đƣợc tiến hành một cỏch tƣơng tự. Cụ quay dƣới ỏp suất giảm để thu hồi dung mụi hữu cơ, thu đƣợc cắn tƣơng ứng với mỗi loại dung mụi ký hiệu lần lƣợt là H, C, E, B. Phần dịch nƣớc cũn lại cụ cỏch thủy đến cạn trong tủ hốt, sau đú cắn đƣợc làm khụ trong tủ sấy ở 50oC thu đƣợc cắn phõn đoạn nƣớc, kớ hiệu W.
31
Sơ đồ quy trỡnh chiết xuất cỏc phõn đoạn từ Mỏn đỉa (Archidendron clypearia
(Jack) I. Niels – Mimosaceae) đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.7:
3.2.2.2. Phõn lập
Kết quả nghiờn cứu dƣợc lý (đƣợc trỡnh bày ở phần 3.3.1) cho thấy trong 5 phõn đoạn cao chiết đem thử H, C, E, B, W, phõn đoạn E (cao chiết ethyl acetat) cú tỏc dụng chống oxy húa mạnh nhất. Do đú, phõn đoạn này đƣợc ƣu tiờn tiến hành chiết xuất, phõn lập cỏc hoạt chất tinh khiết.
Dựng phƣơng phỏp chiết pha rắn để tiến hành phõn lập phõn đoạn E. Cao cắn E đƣợc hũa tan trong một lƣợng methanol tối thiểu, sau đú tẩm với
Hỡnh 3.5. Sơ đồ chiết xuất cỏc phõn đoạn từ cõy Mỏn đỉa.
Bột dƣợc liệu (5,0 kg)
Methanol tuyệt đối, ngõm ở nhiệt độ phũng Chiết 3 đợt, 1 đợt ì 1 tuần Dịch chiết methanol Cắn methanol (750 g) tº, p Phõn tỏn trong nƣớc L ắc p h õn đ oạ n Dịch nƣớc cũn lại – W (145 g) C (145 g) H (100 g) E (250 g) B (105 g) + chloroform + n-hexan + ethyl acetat + n-butanol
32
silicagel theo tỷ lệ silicagel : E = 1:1. Cụ quay chõn khụng dịch vừa tẩm để bay hơi dung mụi, thu đƣợc bột tơi mịn. Chuẩn bị cột sắc ký, chọn cột cú đƣờng kớnh 12cm để chiều cao của mẫu sau khi nạp vào cột khoảng 7cm, cố định cột, lút bụng, cho silicagel pha thƣờng lờn cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 1cm. Sau đú cho lƣợng chất đó tẩm silicagel lờn cột, gừ nhẹ để bột phõn bố đều. Tiến hành chiết cỏc phõn đoạn bằng cỏc hệ dung mụi: n- hexan 100%, hỗn hợp dung mụi n-hexan : aceton theo cỏc tỉ lệ lần lƣợt là (40:1), (20:1), (10:1), (5:1), (1:1), aceton 100% và methanol 100%. Sử dụng 1,5 lớt đối với mỗi hệ dung mụi thu đƣợc 8 phõn đoạn ký hiệu từ E1 – E8.