Húa chất, dụng cụ, mỏy múc

Cỏc hoỏ chất và thuốc thử đạt tiờu chuẩn phõn tớch theo quy định của Dƣợc Điển Việt Nam IV.

Dung mụi: methanol, ethanol, n-butanol, ethyl acetat, chloroform, n- hexan, aceton, acid formic, amoniac, dichloromethan, nƣớc cất 2 lần, acid acetic, javel, xanh methylen, đỏ carmin, glycerin, HCl 10%.

Mụi trƣờng nuụi cấy tế bào MEME, FBS, DMSO và một số húa chất cần thiết của hóng Sigma, GIBCO, Invitrogen.

Chất đối chứng: Paracetamol và Sylimarin (Sigma, US). Thuốc thử: H2SO4 10%/ethanol, dung dịch NH3 đậm đặc.

Silicagel dựng cho sắc ký cột pha thƣờng (Merck, Kielselgel 60), pha đảo (30 - 50m, Fuji Silysia Chemical Ltd.), Dianion HP - 20, Sephadex LH 20, silicagel dựng cho sắc ký lớp mỏng pha thƣờng (Merck, Kielselgel 60 F254, 250 àm), pha đảo RP18 (Merck, RP C - 18 F254)....

Dụng cụ thớ nghiệm: bỡnh chiết, cột sắc ký, bỡnh gạn, ống nghiệm, cỏc dụng cụ thủy tinh, đĩa 96 giếng, eppendof, kim đầu tự, ống li tõm, đĩa petri, kim mũi mỏc, mặt kớnh đồng hồ, dao cắt vi phẫu, lam kớnh, lamen.

Mỏy múc, thiết bị: cõn phõn tớch, mỏy cụ quay Yamoto, tủ sấy Memmert, mỏy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn Bruker AM 500 FT-NMR, mỏy đo OD Microplate Reader, mỏy định lƣợng sinh húa bỏn tự động AU680 của hóng Beckman Coulter, kớnh hiển vi điện tử, mỏy đo phổ khối lƣợng phun mự điện tử AGILENT 1100 LC-MSD Trap.

17

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.2.1. Nghiờn cứu về thực vật.

2.2.1.1. Vi phẫu thõn và lỏ Mỏn đỉa.

Phƣơng phỏp làm tiờu bản tạm thời [11]:

- Dƣợc liệu tƣơi hay khụ đó ngõm mềm cắt ngang thành lỏt cắt mỏng. - Ngõm nƣớc Javen 30 phỳt để tẩy cỏc chất trong cỏc tế bào.

- Rửa nƣớc nhiều lần. - Rửa bằng acid acetic. - Rửa lại bằng nƣớc.

- Nhuộm vi phẫu bằng xanh methylen khoảng 15 giõy. - Rửa bằng nƣớc.

- Nhuộm đỏ carmin khoảng 30 phỳt. - Rửa nƣớc.

- Đặt vi phẫu vào một giọt glycerin trờn phiến kớnh, đậy lỏ kớnh.

- Soi tiờu bản bằng kớnh hiển vi điện tử, chụp ảnh và mụ tả cỏc đặc điểm của vi phẫu.

2.2.1.2. Soi bột thõn và lỏ Mỏn đỉa.

- Dƣợc liệu sau khi thu hỏi đƣợc sấy khụ, nghiền mịn thành bột.

- Cho bột dƣợc liệu lờn trờn lam kớnh cú sẵn giọt glycerin, đậy lamen và quan sỏt cỏc đặc điểm bằng kớnh hiển vi điện tử.

- Chụp ảnh và mụ tả cỏc đặc điểm bột dƣợc liệu.

2.2.2. Nghiờn cứu về húa học

2.2.2.1. Định tớnh một số nhúm chất hữu cơ

- Định tớnh cỏc nhúm hợp chất thiờn nhiờn cú trong cõy bằng cỏc phản ứng húa học đặc trƣng và sắc ký lớp mỏng [1], [3].

18

- Cho khoảng 20g dƣợc liệu vào bỡnh nún dung tớch 250ml, thờm nƣớc cất, đun sụi trong vài phỳt, để nguội, lọc thu đƣợc dịch chiết nƣớc của Mỏn đỉa. Sử dụng dịch chiết nƣớc tiến hành cỏc phản ứng định tớnh sau:

 Thờm 1 ớt bột Na2CO3 thấy cú bọt khớ CO2 acid hữu cơ  Phản ứng với dung dịch gelatin 1%

Phản ứng với FeCl3

 Phản ứng với thuốc thử Fehling đƣờng khử - Cho khoảng 20g dƣợc liệu vào bỡnh nún dung tớch 250ml, chiết bằng cồn 900, lọc dịch chiết để tiến hành cỏc phản ứng định tớnh sau:

 Phản ứng đúng - mở vũng lacton Phản ứng diazo húa

Phản ứng chuyển húa đồng phõn cis-trans  Phản ứng Cyanidin

Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% Phản ứng với NH3

 Hiện tƣợng tạo bọt

Phản ứng với H2SO4 đậm đặc

 Phản ứng Ninhydrin acid amin  Nhỏ vài giọt dịch chiết lờn giấy lọc, hơ núng cú vết mờ chất bộo

- Cho khoảng 5g dƣợc liệu vào bỡnh nún dung tớch 100ml, thấm ẩm dƣợc liệu bằng dung dịch NH4OH 6N. Sau 30 phỳt, thờm chloroform ngập dƣợc liệu, lắc, đậy kớn. Ngõm 12h, gạn dịch chloroform vào bỡnh gạn, lắc với dung dịch H2SO4 1N, gạn lấy dịch chiết acid để làm phản ứng.

Phản ứng Dragendorff Phản ứng Mayer Phản ứng Bouchardat tanin coumarin flavonoid saponin alcaloid

19

- Lấy khoảng 1g dƣợc liệu cho vào ống nghiệm, thờm 10ml dung dịch H2SO4 1N. Đun sụi trực tiếp 10 phỳt. Để nguội, lọc. Thờm ether vào dịch lọc, lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nƣớc, lấy lớp ether làm phản ứng định tớnh.

Phản ứng Bortraeger

Phản ứng với dung dịch NaOH 10%

- Dịch chiết cồn loại bỏ chỡ acetat lắc 3 lần với chloroform

Lấy dịch chloroform, cụ cắn hũa cắn trong cồn 900

để làm phản ứng định tớnh. Phản ứng Legal Phản ứng Baljet Phản ứng Libermann steroid 2.2.2.2. Chiết xuất và phõn lập a. Chiết xuất

Phƣơng phỏp chiết xuất đƣợc sử dụng là phƣơng phỏp ngõm. Bột dƣợc liệu đƣợc ngõm ở nhiệt độ phũng bằng dung mụi methanol. Thời gian chiết xuất: chiết 3 đợt, mỗi đợt chiết trong một tuần. Gộp dịch chiết thu đƣợc bốc hơi dung mụi dƣới ỏp suất giảm để thu đƣợc cao toàn phần.

b. Phõn lập

 Sắc ký cột

- Nguyờn tắc: Trong sắc ký cột chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố định đƣợc nhồi trong cỏc ống hỡnh trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy, cú thể khai triển dung mụi liờn tục với nhiều hệ dung mụi khỏc nhau từ phõn cực yếu đến phõn cực mạnh [3]. Tựy theo chất đƣợc sử dụng trong cột mà ta cú cột hấp phụ, cột phõn bố, cột trao đổi ion.

- Húa chất nhồi cột: cột hấp phụ sử dụng chất hấp phụ là silicagel pha thƣờng (0,040-0,063 mm, Merck) và silicagel pha đảo YMC (30-50 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.), cột trao đổi ion Dianion HP-20, cột lọc qua gel Sephadex LH- 20.

anthranoid

20

2.2.2.3. Xỏc định cấu trỳc

Xỏc định cấu trỳc cỏc hợp chất phõn lập đƣợc dựa trờn cỏc thụng số vật lý nhƣ thể chất, màu sắc và cỏc dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn (NMR), phổ khối lƣợng phun mự điện tử (MS) [9].

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn đƣợc đo trờn mỏy Bruker Avance AM500 FT – NMR với chất nội chuẩn là tetramethyl silane (TMS), dung mụi đo phổ: CD3OD, DMSO – d6, CDCl3 của hóng Sigma – Aldrich, phổ MS đƣợc đo trờn mỏy AGILENT 1100 LC-MSD Trap. Mỏy đo phổ tại Viện Hoỏ học - Viện Hàn Lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.

2.2.3. Phƣơng phỏp nghiờn cứu tỏc dụng sinh học 2.2.3.1. Thử độc tớnh cấp: [15], [55], [59]. 2.2.3.1. Thử độc tớnh cấp: [15], [55], [59].

Phƣơng phỏp:

64 chuột BALB/c khoẻ mạnh, khối lƣợng 26±2 g, khụng phõn biệt giống, nuụi tại khu nuụi động vật của Viện Cụng nghệ Sinh học, đƣợc chia làm 8 lụ (8 chuột/lụ), và bị bỏ đúi hoàn toàn 16 h trƣớc khi cho uống cao dịch chiết ethyl acetat Mỏn đỉa một lần duy nhất ở cỏc ở nồng độ 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000 và 12000 mg/kg thể trọng (kgP) tƣơng ứng với 8 lụ thớ nghiệm. Sau khi cho uống 1-2 giờ, chuột đƣợc nuụi dƣỡng bỡnh thƣờng trở lại (cho ăn, uống tự do) và theo dừi liờn tục trong 72 giờ để xỏc định số chuột chết trong từng lụ và tớnh giỏ trị LD50 theo cụng thức của Abraham (1978) và Turner (1965).

Cụng thức tớnh giỏ trị LD50 k-1

LD50 = Xk - d/2 - d/n x mi i=2

Trong đú: LD50: liều chết 50% động vật thớ nghiệm n: số động vật sử dụng trong từng lụ thớ nghiệm

21

k: số lụ động vật

mi: số động vật chết đếm theo từng lụ trong 72 giờ d: khoảng cỏch giữa cỏc mức liều

Xk: liều thuốc thấp nhất gõy chết 100% động vật thớ nghiệm

2.2.3.2. Thử tỏc dụng chống oxy húa invitro [19], [20], [26], [27].

Phương phỏp phõn lập trực tiếp tế bào gan chuột: Chuột BALB/c khoẻ mạnh đƣợc sử dụng để tỏch tế bào gan. Gõy chết chuột bằng ether, tỏch lấy gan. Gan chuột sau khi tỏch đƣợc rửa bằng PBS cú 10% khỏng sinh PSF (Penicillin-Streptomicin-Fungizone) (Invitrogen) sau đú dựng panh, kộo, kim tiờm gạt, tỏch tế bào gan trong PBS. Thu dịch cú tế bào gan, li tõm, loại bỏ dịch nổi. Cặn tế bào đƣợc hoà trong NH4Cl để phỏ vỡ hồng cầu. Sau khi li tõm cắn tế bào thu đƣợc hoà lại vào mụi trƣờng MEME cú 10% FBS.

Phộp thử sinh học kiểm tra khả năng chống oxy hoỏ của hoạt chất trờn tế bào gan.

Nguyờn lớ phộp thử: H2O2 khụng những là một gốc tự do phổ biến mà cũn là một chất chuyển hoỏ thƣờng xuyờn xuất hiện ở trong cỏc tế bào động vật, đƣợc tạo ra do cỏc phản ứng khử oxy sinh học. Tuy nhiờn, H2O2 cũng là nguyờn nhõn gõy ra sự hỡnh thành cỏc gốc tự do nội sinh khỏc (vớ dụ nhƣ HO.

) thụng qua cỏc phản ứng oxy hoỏ khử khỏc nhau trong tế bào và điều đú ảnh hƣởng nghiờm trọng tới sự sống cũn của tế bào. Để kiểm chứng khả năng bảo vệ tế bào trƣớc cỏc tỏc nhõn oxy hoỏ và cỏc gốc tự do của cỏc hoạt chất tiềm năng, cỏc nhà nghiờn cứu đó sử dụng tế bào gan làm mụ hỡnh nghiờn cứu. Trong đú, tế bào gan với cỏc hệ enzyme khử độc nhƣ glutathione S- transferases (GSTs), NAD(P)H:(quinone-acceptor) oxydoreductase (QR) v.v. luụn là cơ quan thải độc cho cơ thể, sẽ bị H2O2 tỏc động trực tiếp và hoạt chất cần kiểm tra sẽ đƣợc đƣa vào nhƣ chất bảo vệ. Nếu hoạt chất cú thể bảo vệ tế bào gan khỏi tỏc động của H2O2 sẽ đƣợc xem là cú hoạt tớnh chống oxy hoỏ.

22

Nội dung của phộp thử sinh học:

 Tế bào gan từ gan chuột sau khi phõn lập đƣợc nuụi ổn định 1-2 ngày, sau đú đƣa vào đĩa thớ nghiệm 96 giếng với mật độ 1 x 104

tb/giếng để nuụi qua đờm trong tủ ấm 5% CO2, ở 37o

C.

 Thờm chất nghiờn cứu hoặc Curcumin (đối chứng dƣơng) ở cỏc nồng độ khỏc nhau, ủ trong 2h.

 Thờm 100 M H2O2 vào mỗi giếng và để tỏc động trong 2h.

 Để xỏc định số tế bào gan sống sút sau tỏc động của H2O2 cũng nhƣ tỏc động bảo vệ của hoạt chất nghiờn cứu, MTT nồng độ 1mg/ml (50 l/giếng) sẽ đƣợc đƣa vào cỏc giếng và ủ tiếp trong 4h ở 37o

C.

 Loại bỏ toàn bộ dịch nổi và đƣa vào mỗi giếng 100 l/giếng DMSO 100%  Đo mật độ quang học (giỏ trị OD – Optical Density) của chất formazan tạo thành bằng mỏy Microplate Reader ở 492 nm.

 Tất cả thớ nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần để trỏnh sai số.

 Cỏc số liệu đƣợc xử lớ bằng phần mềm TableCurve 2D phiờn bản số 4 và EXEL để tớnh giỏ trị Standard Deviation. Độ chớnh xỏc của số liệu đƣợc tớnh bằng R2. Nếu R2 ≥ 0,95 thỡ kết quả đƣợc xem là đỏng tin cậy với sai số P ≤ 0,05

% tế bào gan sống sút = [OD(chất thử) - OD(H2O2)] x 100 OD(Tế bào) - OD(H2O2)

Trong đú:

OD(chất thử), OD(H2O2), OD(Tế bào) lần lƣợt là giỏ trị mật độ quang học đo ở giếng cú chất cần kiểm tra hoạt tớnh, ở giếng đối chứng õm (chỉ gõy chết tế bào bằng H2O2) và ở giếng mà tế bào hoàn toàn khỏe mạnh, khụng bị gõy chết bằng H2O2

23

2.2.3.3. Thử tỏc dụng bảo vệ gan, tỏc dụng chống oxy húa invivo

a. Nguyờn tắc:

- Gõy viờm gan chuột nhắt trắng bằng paracetamol. Paracetamol gõy độc đối với tế bào gan, đặc biệt là khi dựng liều cao. Hợp chất này đƣợc chuyển húa bởi cytochrom P450 tạo ra chất chuyển húa độc hại là N-acetyl-p- benzoquinone imine (NAPQI). Paracetanol làm thỏo rỗng GSH và liờn kết đồng húa trị NAPQI với phần cystein cũn lại trờn protein làm sản sinh cỏc sản phẩm 3-(cysteine-S-yl) APAP (N-acetyl- p- aminophenol) gõy hoại tử tế bào gan và kết quả là làm tăng men gan. Định lƣợng men gan để đỏnh giỏ tỏc dụng của mẫu thử [10], [23].

b. Cỏch tiến hành:

Gõy tổn thƣơng gan bằng paracetamol (PAR) với liều 400 mg/kg, paracetamol đƣợc pha trong dung dịch dung dịch sinh lớ với nồng độ 50 mg/ml. 36 chuột BALB/c cú khối lƣợng 26 g ± 2 g đƣợc chia làm 6 lụ (6 con/lụ)

- Lụ 1: uống DMSO 10%: 0,2 ml/con/ngày (chuột khỏe mạnh bỡnh thƣờng).

- Lụ 2: uống DMSO 10%: + Paracetamol (bệnh lý)

- Lụ 3, 4, 5: uống cao chiết ethyl acetat liều lần lƣợt là 500 mg/kg/ngày, 1000 mg/kg/ngày, 2000 mg/kg/ngày.

- Lụ 6: uống Silymarin 50 mg/kg/ngày (chứng dƣơng)

Chuột ở tất cả cỏc lụ đƣợc uống cao chiết và thuốc cần nghiờn cứu liờn tục 7 ngày trƣớc và 2 ngày sau khi gõy độc cho gan, mỗi ngày cho uống 1 lần vào buổi sỏng. Ngày thứ 7 sau uống mẫu 1 giờ, nhịn đúi 14-16 giờ trƣớc đú, gõy độc gan bằng cỏch cho uống paracetamol (chỉ cho cỏc lụ 2, 3, 4, 5) với liều paracetamol 400 mg/kg/1 lần duy nhất.

24

Sau 48 giờ uống paracetamol, lấy mỏu định lƣợng aminotransferase (AST, ALT), cõn khối lƣợng gan, quan sỏt đại thể gan và xỏc định hàm lƣợng MDA trong gan.

 Định lượng aminotransferase

Định lƣợng aminotransferase (AST, ALT) trong huyết thanh chuột đƣợc định lƣợng bằng phƣơng phỏp so màu, thực hiện trờn mỏy định lƣợng sinh hoỏ bỏn tự động AU680 của hóng Beckman Coulter.

 Kiểm tra trực quan gan

Sau toàn bộ thớ nghiệm và sau khi lấy mỏu xột nghiệm, chuột đƣợc mổ để kiểm tra trực quan. Chụp ảnh gan động vật thớ nghiệm.

 Xỏc định hàm lượng MDA trong gan

Tỏch gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1 : 10 (gan : dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 – 50C. Lấy 2 ml dịch đồng thể, thờm vào 1 ml dung dịch đệm Tris - HCl, ủ ở 370C trong 1 giờ. Kết thỳc phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%, ly tõm 5000 vũng/phỳt trong 5 phỳt, lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8 % ở 95-1000C trong 15 phỳt và đo màu ở λ = 532 nm.

Tớnh toỏn kết quả: Hàm lƣợng MDA (nM/ml) đƣợc tớnh theo phƣơng trỡnh hồi qui chất chuẩn MDA: y = 0,0637x - 0,0029 (R2 = 0,9981).

CnMMDA/ml dịch đồng thể = (ODthử + 0,0029)/0,0637. Sau khi tớnh đƣợc hàm lƣợng MDA (nM/ml dịch đồng thể)

 Phương phỏp xử lớ số liệu

Cỏc số liệu đƣợc sử lớ trờn Excel, thuật toỏn thống kờ student t’test, F’test và phƣơng phỏp phõn tớch phƣơng sai một nhõn tố ngẫu nhiờn (one way ANOVA) và sử dụng hệ số LSD (least-significant difference) để kiểm tra sự sai khỏc cú ý nghĩa so với đối chứng õm, với đối chứng paracetamol (PAR), với Silymarin. Nếu p<0,05 đƣợc coi là sai khỏc cú ý nghĩa, nếu p>0,05 sự sai khỏc là khụng cú ý nghĩa thống kờ.

25

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU 3.1. NGHIấN CỨU VỀ THỰC VẬT

3.1.1. Đặc điểm vi phẫu

Cỏc đặc điểm vi phẫu lỏ và vi phẫu thõn đƣợc thể hiện ở hỡnh 3.1 và 3.2.  Vi phẫu lỏ:

Hỡnh 3.1. Ảnh vi phẫu lỏ Mỏn đỉa 1. Lụng che chở 4. Mụ mềm vỏ 7. Gỗ

2. Biểu bỡ 5. Mụ cứng 8. Mụ giậu

3. Mụ dày 6. Libe 9. Mụ khuyết

- Phần gõn lỏ: Gõn lỏ lồi ớt ở phớa trờn, lồi nhiều hơn ở phớa dƣới. Từ ngoài vào trong cú: biểu bỡ trờn và dƣới là một hàng tế bào nhỏ. Lớp biểu bỡ mang nhiều lụng che chở. Sỏt biểu bỡ trờn và dƣới là mụ dày, gồm cỏc tế bào hỡnh đa giỏc. Mụ mềm vỏ cấu tạo là cỏc tế bào thành mỏng. Sỏt với mụ mềm vỏ là mụ cứng. Mụ cứng cấu tạo bởi cỏc tế bào cú kớch thƣớc nhỏ, thành dày tạo thành cung lớn bao quanh bú libe-gỗ.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

26

- Phần phiến lỏ: Biểu bỡ ở phiến lỏ giống với ở phần gõn lỏ. Dƣới biểu bỡ là mụ giậu, gồm 1 hàng tế bào hỡnh chữ nhật xếp đứng, vuụng gúc với biểu bỡ trờn. Rải rỏc trong mụ giậu cú cỏc tinh thể canxi oxalat. Trong cựng là mụ khuyết, rải rỏc cú cỏc thể cứng.

 Vi phẫu thõn

Hỡnh 3.2. Vi phẫu thõn Mỏn đỉa

Mặt cắt vi phẫu thõn to hỡnh trũn, thõn nhỏ hỡnh đa giỏc. Từ ngoài vào trong cú: lớp biểu bỡ gồm 1 hàng tế bào xếp đều đặn, mang nhiều lụng che chở đa bào. Tiếp theo là mụ mềm vỏ gồm 4-5 lớp tế bào cú thành mỏng, kớch thƣớc to nhỏ khụng đều nhau. Trong mụ mềm vỏ là cỏc tế bào mụ cứng cú thành dày, xếp thành từng đỏm ở ranh giới giữa mụ mềm vỏ và libe. Libe là

Chỳ thớch: 1: Lụng che chở 4: Mụ cứng 7: Mụ mềm ruột 2: Biểu bỡ 5: Libe 3: Mụ mềm vỏ 6: Gỗ 3 4 5 6 7 2 1

27

những tế bào nhỏ, thành mỏng, tạo thành vũng liờn tục. Gỗ gồm cỏc mạch gỗ