Thử độc tính tế bào in vitro đƣợc thực hiện tại Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Chungbuk, Hàn Quốc theo phƣơng pháp MTT.
Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời), MCF-7 (tế bào ung thƣ vú ngƣời), PC-3 (tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến ngƣời), AsPC-1 (tế bào ung thƣ tụy ngƣời).
Kết quả giá trị IC50 của các chất trên 4 dòng tế bào đƣợc trình bày trong bảng 4.1 phần 4.3.
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
4.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC
Các acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol đƣợc tổng hợp theo quy trình 4 bƣớc.
Ở bƣớc đầu tiên, các thiosemicarbazon IIa-i đƣợc tạo nên bằng cách ngƣng tụ các benzaldehyd Ia-i với thiosemicarbazid. Phản ứng xảy ra dễ dàng và đạt hiệu suất cao.
Bƣớc thứ 2, phản ứng tạo vòng nội phân tử của các chất IIa-i với tác nhân FeCl3 tạo thành các dẫn xuất 2-amino-5-aryl-1,3,4-thiadiazol (IIIa-i) [33]. Trong phản ứng này, tác nhân oxi hóa (ví dụ các acid Lewis nhƣ FeCl3, NH4Fe(SO4)2,...) đóng vai trò quan trọng.
Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng đóng vòng tổng hợp 2-amino-5-aryl-1,3,4-thiadiazol
Bƣớc thứ 3, ghép nối IIIa-i với acid suberic monomethyl ester sử dụng CDI nhƣ một tác nhân hoạt hóa tạo ra IVa-i.
Sơ đồ 4.2: Cơ chế hoạt hóa của CDI
Thực hiện bƣớc này dụng cụ phải khô hoàn toàn, các hóa chất và dung môi phải khan nƣớc do CDI dễ phân hủy dẫn đến không còn khả năng hoạt hóa acid monomethyl suberic nếu tiếp xúc với nƣớc.
Bƣớc cuối cùng, phản ứng giữa ester IVa-i với hydroxylamin trong môi trƣờng kiềm cho ra sản phẩm cuối cùng Va-i. Để tránh phân hủy ester thành acid carboxylic bởi dung dịch NaOH đậm đặc, cần làm lạnh hỗn dịch IVa-i và NaOH trƣớc khi cho vào bình phản ứng. Phản ứng cũng cần thực hiện ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn để tránh phân hủy nhóm amid. Lƣợng NaOH phải dƣ để chuyển hết NH2OH.HCl thành NH2OH tan và đảm bảo acid hydroxamic tạo thành tan hết trong dung dịch phản ứng.
4.2. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 4.2.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Dữ liệu về phổ hồng ngoại của 9 chất tổng hợp đƣợc trình bày trong mục 3.3.1 và phổ đồ trong phần phụ lục. Chúng tôi tập trung phân tích phổ vùng nhóm chức để xác định sản phẩm tạo ra với các nhóm chức đặc trƣng.
- Trên phổ đồ của một số chất (Vc, Ve) có thể quan sát thấy vân hấp thụ của dao động hóa trị O-H acid mạnh và tù (3400 cm-1
).
- Trong cấu trúc có 2 liên kết –NH-CO- nên phổ đồ của cả 9 chất đều xuất hiện 1-2 vân hấp thụ của dao động hóa trị N-H amid cũng nhƣ vân hấp thụ của dao
động hóa trị C=O amid. Các dao động νN-H có số sóng từ 3361-3139 cm-1, các dao động νC=O có số sóng từ 1718-1638 cm-1.
- Phần cầu nối alkyl của các chất tổng hợp đƣợc cũng cho thấy sự có mặt trên phổ đồ với dao động hóa trị CH2 từ 2730-2933 cm-1.
- Trên phổ đồ của các chất cũng quan sát thấy dao động hóa trị của các liên kết C=C vòng thơm từ 1602-1435 và C-H vòng thơm từ 3025-3008 cm-1.
Việc quan sát đƣợc các vân hấp thụ đặc trƣng của các nhóm chức –OH, - NH, –C=O và cầu nối alkyl cho thấy phản ứng tạo acid hydroxamic đã xảy ra. Chúng tôi tiếp tục phân tích các dữ liệu phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất đã tổng hợp đƣợc.
Dƣới đây là hình ảnh minh họa phổ hồng ngoại của chất Vb.
Hình 4.1: Phổ hồng ngoại của chất Vb
4.2.2. Phổ khối (MS)
Các chất tổng hợp đƣợc đƣợc đo phổ khối lƣợng ở chế độ không phân mảnh ESI (-). Trên phổ đồ của mỗi chất đều xuất hiện một pic ion cƣờng độ mạnh, có số khối bằng [M-H]- đúng với từng chất (dữ liệu mục 3.3.1 và phụ lục).
Hình 4.2: Phổ khối lượng của chất Vb
4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)
Để khẳng định chắc chắn cấu trúc, ngoài phổ hồng ngoại và phổ khối lƣợng, 9 chất đã tổng hợp đƣợc đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H, 13C. Dữ liệu phổ đƣợc trình bày trong mục 3.3.1 và phổ đồ ở phần phụ lục. Kết quả phổ đồ của cả 9 chất đều thể hiện sự có mặt của các dị vòng và cầu nối alkyl với đầy đủ tín hiệu proton và carbon.
* Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H (1H-NMR)
- Các chất đều có cấu trúc chứa nhóm hydroxamic và liên kết amid nên quan sát thấy sự có mặt của proton –NH (δ = 10,33-12,85 ppm), -OH acid (δ = 8,67-8,71 ppm). H của –NHCO- vị trí 7 cộng hƣởng ở trƣờng yếu nhất với độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 12,57-12,85 ppm, do hiệu ứng hút điện tử của vòng thiadiazol làm hạt nhân bị giảm sự chắn tại chỗ. H của –NH trong nhóm chức hydroxamic –NHOH linh động hơn trong môi trƣờng DMSO nên cộng hƣởng ở trƣờng mạnh hơn (δ = 10,33-10,42 ppm). Các proton này linh động và dễ bị trao (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đổi hoặc hỗ biến nên ở một số chất không cho tín hiệu của proton trong –NH, -OH trên phổ đồ (Va, Vb, Vc, Ve, Vf).
- Một nhóm các proton quan trọng trong cấu trúc của dãy chất là các proton mạch nhánh. Cả 9 chất đều thể hiện đủ số proton mạch nhánh với độ dịch chuyển trong khoảng 1,20-2,52 ppm. Các chất Vc, Vf có nhóm CH3 gắn trên dị vòng nên cho tín hiệu 3H dạng singlet ở vị trí 2,36-2,48 ppm.
- Trên phổ đồ của dãy chất cũng quan sát đƣợc đầy đủ các proton trong dị vòng gắn với vòng thiadiazol. Ở dẫn chất dị vòng furan (Va-c), các proton thơm dao động trong khoảng 6,32-7,93 ppm; ở dẫn chất dị vòng thiophen (Vd-f), khoảng này là 6,87-7,75 ppm và đối với dị vòng pyridin (Vg-i) là 7,51-9,12 ppm.
Dƣới đây là hình ảnh minh họa phổ 1H-NMR của chất Vd.
* Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR)
Phổ 13
C-NMR có ƣu điểm là toàn bộ carbon trong phân tử các chất đều cho tín hiệu đƣợc tách rõ ràng dạng mũi tên đơn do đƣợc đo ở dạng phổ 13C khử hoàn toàn tƣơng tác spin-spin.
- Hai carbon của khung thiadiazol (C2’, C5’) có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 171,58-172,19 ppm và 151,33-160,03 ppm.
- Hai carbon trong nhóm carbonyl (C=O) (C1’, C8’) có độ dịch chuyển trong khoảng 157,15-169,65 ppm.
- Các carbon trong dị vòng cũng đƣợc quan sát rõ: Dị vòng furan có 4C dao động trong khoảng 108,85-154,60 ppm, dị vòng thiophen có 4C dao động từ 114,73-142,97 ppm, dị vòng pyridin có 5C dao động từ 120,79-150,70 ppm.
- Phần cầu nối alkyl cho tín hiệu cộng hƣởng của carbon trong khoảng 24,31-34,89 ppm.
- Vc, Vf có thêm nhóm thế CH3 gắn trên dị vòng có dao động ở vị trí 13,38- 15,09 ppm.
Dƣới đây là hình ảnh minh họa phổ 13
C-NMR của chất Vb.
Hình 4.4: Phổ 13C-NMR của chất Vb
Từ những kết quả biện luận các loại phổ đồ, chúng tôi khẳng định đã tổng hợp đƣợc 9 chất có cấu trúc đúng nhƣ dự kiến và sản phẩm tinh khiết.
4.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC
Để hỗ trợ trong quá trình thiết kế cấu trúc và tìm hiểu khả năng gắn vào trung tâm hoạt động trên enzym HDAC của các chất, chúng tôi tiến hành nghiên cứudocking 9 chất Va-i. So sánh mô hình tƣơng tác với HDAC8 của các chất Va-i
và SAHA có thể thấy phần cầu nối giữa nhóm khóa hoạt động và nhóm gắn với Zn2+ của 9 chất cũng nhƣ của SAHA có cấu trúc tƣơng đối giống nhau. Nhƣ vậy cầu nối với độ dài 6C của các chất tổng hợp đƣợc có nhiều khả năng đƣa đƣợc nhóm -NHOH tiến gần ion Zn2+ giống nhƣ SAHA. Bên cạnh đó, năng lƣợng liên kết của các chất Va-i với trung tâm hoạt động của HDAC8 đƣợc dự đoán từ -7,1 đến -6,4 kcal/mol, nghĩa là đều thấp hơn SAHA (-4,4 kcal/mol), chứng tỏ các chất cóái lực với HDAC8 mạnh hơn SAHA. Có thể sự thay đổi nhóm nhận diện bề mặt đã làm tăng lực liên kết của các chất với phần vành của enzym HDAC8. Tóm lại, kết quả docking cho thấy các chất Va-i phù hợp với hƣớng thiết kế cấu trúc nhằm tìm kiếm những chất có khả năng ức chế HDAC. Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiếp tục tiếnhành tổng hợp hóa học và thử tác dụng sinh học.
Bƣớc đầu nghiên cứu hoạt tính sinh học, các acid hydroxamic tổng hợp đƣợc (Va-i) đƣợc đánh giá khả năng ức chế HDAC ở nồng độ 1M. Kết quả ở hình 4.5 cho thấy Va, Vb, Vd, Vg ức chế enzym rõ rệt tƣơng tự chất chuẩn dƣơng tính SAHA. Vh, Vi thể hiện tác dụng ở mức độ yếu và rất yếu, còn Vc, Ve, Vf hầu nhƣ không ức chế enzym HDAC. Kết quả thu đƣợc gợi ý rằng: 1) Các dị vòng (gắn vào vòng thiadiazol) đều cho khả năng ức chế HDAC mạnh, 2) Việc gắn thêm các nhóm thế vào dị vòng không thích hợp để ức chế enzym (gắn 5-Br, 5-CH3 vào thiophen hoặc 5-CH3 vào furan làm mất hẳn hoạt tính), 3) Tác dụng của dẫn chất pyridin phụ thuộc vào vị trí của N (N của pyridin càng xa vị trí gắn, khả năng ức chế HDAC càng giảm).
Hình 4.5: Kết quả phân tích Western blot của các chất Va-I (nồng độ thử 1 M)
Để có thể gây ra độc tính với tế bào ung thƣ, các chất phải thấm đƣợc qua màng sinh học tiếp cận với HDAC. Vì thế, chúng tôi tiếp tục tiến hành thử độc tính tế bào in vitro của 9 chất đã tổng hợp. Kết quả cho ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro
Chất R KLPT IC50 (M)* SW620 MCF-7 PC-3 AsPC-1 Va 338 0,29 0,60 0,42 0,34 Vb 417 0,25 0,31 0,46 0,43 Vc 352 0,65 0,39 0,60 0,88 Vd 354 0,29 0,35 0,45 0,28 Ve 433 >20 >20 >20 >20 Vf 368 0,46 0,39 0,43 0,86 Vg 349 0,57 0,52 0,47 0,32 Vh 349 0,60 0,37 0,91 1,05 Vi 349 3,57 3,01 6,03 4,32 SAHA 264 1,91 6,34 4,28 3,60
*Nồng độ của chất gây ra sự giảm 50% số lượng tế bào, số liệu được lấy trung bình ba kết quả với độ lệch dưới 10%.
SAHA: acid suberoylanilid hydroxamic.
Kết quả thử trên 4 dòng tế bào ung thƣ (SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời), MCF-7 (tế bào ung thƣ vú ngƣời), PC-3 (tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến
ngƣời), AsPC-1 (tế bào ung thƣ tụy ngƣời)) cho thấy tất cả các chất tổng hợp đƣợc (trừ Ve) đều có độc tính mạnh trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm (IC50 từ 0,25-6,03
M), đặc biệt:
- Trên dòng tế bào ung thƣ đại tràng (SW620), Va, Vb, Vd thể hiện tác dụng mạnh hơn SAHA 6-7 lần (với giá trị IC50 lần lƣợt là 0,29; 0,25 và 0,29 M, so với SAHA là 1,91M). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cả Vb-d,Vf, Vh và Vi đều có giá trị IC50 trên MCF-7 từ 0,31-0,39M, mạnh hơn SAHA (6,34M) 16-20 lần.
- Khả năng ức chế tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến (PC-3) của Va, Vb, Vd, Vf,
và Vg mạnh hơn SAHA 9-10 lần (với IC50 từ 0,42-0,47M, so với SAHA 4,28M). - Tác dụng kháng tế bào ung thƣ tụy (AsPC-1) của Va, Vd, Vg (với IC50 từ 0,28-0,34M) cũng mạnh hơn SAHA 10-12 lần (IC50=3,60M).
Kết quả này khá tƣơng đồng với kết quả thử tác dụng ức chế enzym HDAC:
Ve không ức chế enzym HDAC có tác dụng gây độc tế bào kém nhất với IC50>20M trên cả 4 dòng tế bào, Vi cho IC50 cao hơn hẳn các chất còn lại 5-15 lần. Tuy nhiên, với các chất Vc, Vf, dù tác dụng ức chế HDAC không quan sát đƣợc ở nồng độ 1M trên mô hình thử nghiệm Western Blot nhƣng cho vẫn cho tác dụng kháng tế bào ung thƣ tƣơng đối mạnh. Đây là một kết quả thú vị cần đƣợc nghiên cứu thêm.
Nhƣ vậy, các acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol tổng hợp đƣợc (Va-d, Vf-i) đều cho hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro mạnh. Việc gắn nhóm thế có hiệu ứng đẩy điện tử (5-CH3) vào dị vòng làm giảm nhẹ hoạt tính của dẫn chất: chẳng hạn với dẫn chất vòng furan, Vc (gắn thêm CH3) làm giảm tác dụng trên trên SW620, AsPC-1 hơn 2 lần so với Va (không có nhóm thế), thể hiện ở giá trị IC50 = 0,65; 0,88M (tƣơng ứng trên từng dòng tế bào) so với Va là IC50 = 0,29; 0,34M; kết quả tƣơng tự với dẫn chất 5-CH3 trên dị vòng thiophen. Gắn nguyên tử halogen với hiệu ứng hút điện tử (5-Br) gây ra các tác động khác nhau
AsPC-1 của Vb gắn Br so với Va lần lƣợt là 0.25 và 0,29M; 0,31 và 0,60M; 0,46 và 0,42M; 034 và 0,43M. Trong khi, gắn 5-Br vào dị vòng thiophen (Ve) lại làm giảm hẳn hoạt tính (IC50>20M) so với Vd (không có Br).
Có thể dự đoán rằng các nhóm thế trên vòng khiến cho cấu trúc phân tử của các chất trở nên cồng kềnh hơn và thay đổi sự phân bố điện tử trong vòng tạo hiệu ứng không gian làm cản trở, hoặc giảm lực liên kết của nhóm khóa hoạt động (vòng thơm) với kênh enzym của HDAC. Nguyên tử halogen (Br) khi gắn vào dị vòng furan và thiophen có thể làm giảm hoặc mất hoàn toàn khả năng liên kết hydro của dị tố trong vòng với phần vành (có thể là một yếu tố quan trọng với hoạt tính) gây tăng hoặc mất hoạt tính của dẫn chất. Tùy loại dị vòng để lựa chọn nhóm thế tạo ra sự phân bố điện tử và cấu trúc không gian phù hợp.
Dị vòng pyridin nhìn chung có hoạt tính yếu hơn dị vòng furan và thiophen. Khả năng tác dụng của dị vòng pyridin phụ thuộc vào vị trí gắn vòng: N càng xa mạch nhánh tác dụng càng giảm (Vg có N ở vị trí ortho có IC50 trên PC3, AsPC-1 nhỏ hơn Vh (có m-N) 2-3 lần, và nhỏ hơn 5-7 lần IC50 của Vi (có p-N) trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm).
So sánh hoạt tính của một số acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4- thiadiazol đã tổng hợp đƣợc (Va-i) với một số acid hydroxamic mang khung 5- phenyl-1,3,4-thiadiazol đã công bố trên tạp chí Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry của tác giả Nguyễn Hải Nam và nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (bảng 4.1) [21] cho thấy nhìn chung các dẫn chất dị vòng cho hoạt tính tốt hơn vòng phenyl. Chẳng hạn, dẫn chất của dị vòng pyridin: Vh tác dụng mạnh hơn dẫn chất phenyl (10a) gần 5 lần trên MCF-7 (IC50(Vh)= 0,37M, IC50(10a)= 1,80M), Vg mạnh hơn 10a hơn 8 lần trên AsPC- 1 (với IC50 lần lƣợt là 0,32M và 2,71M). Có thể sự gia tăng các nguyên tố dị vòng (O, S) trong nhóm nhận diện bề mặt của 9 dẫn chất 5-aryl-1,3,4-thiadiazol mới tổng hợp đƣợc làm tăng tƣơng tác Van der Waals hoặc hydro của các chất với các acid amin trên miệng túi enzym HDAC, từ đó tăng cƣờng hoạt tính.
Bảng 4.2: So sánh tác dụng kháng tế bào ung thư của Va-d, Vf-h với một số dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol
Chất R IC50 (M) MCF-7 PC-3 AsPC-1 Va 0,60 0,42 0,34 Vb 0.132 0.191 0.179 Vc 0.139 0.211 0.311 Vd 0,35 0,45 0,28 Vf 0.144 0.159 0.316 Vg 0,52 0,47 0,32 Vh 0,37 0,91 1,05 10a H 1,80 0,88 2,71 10b 2-Cl 1,23 1,42 0,63 10c 3-Cl 1,23 1,76 1,10 10d 4-Cl 0,73 0,84 1,34 10e 4-F 8,05 2,92 1,88 10f 4-Br 1,27 0,83 0,08 10g 4-CH3 20,78 14,90 6,38 10m 3,4-CH2OCH2- 2,15 2,54 3,04 SAHA 6,34 4,28 3,60
Nhìn chung, ngoại trừ Ve, 8 chất đã tổng hợp đƣợc đều bộc lộ tác dụng kháng ung thƣ rất tốt. Ngoài những qui luật chung đã đƣợc rút ra hoặc dự đoán, khả năng tác dụng của từng chất còn tùy thuộc vào từng dòng ung thƣ khác nhau (chẳng hạn, Va tác dụng trên SW620, PC3 mạnh hơn Vd, Vg, nhƣng yếu hơn trên MCF-7,
loại và số lƣợng HDAC cũng nhƣ mức độ ảnh hƣởng của HDAC trên từng loại bệnh lý khác nhau.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên có thể rút ra một số kết luận nhƣ sau:
Tổng hợp và khẳng định cấu trúc
Đã tổng hợp đƣợc 9 dẫn chất acid hydroxamic mới:
N1-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (Va). N1-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (Vb). N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vc). N1-hydroxy-N8-[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vd). N1-[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (Ve). N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylthiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid