VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.đối tượng, vật liệu, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu
3.3.2Phương pháp nghiên cứu trong phòng thắ nghiệm
Môi trường nuôi cấy
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng các loại môi trường: PGA, WA, nước quả ổi, nước lá ổi, môi trường PGA thuốc.
Môi trường WA (Water - Agar): - Thành phần:
Agar : 20 g
Nước cất : 1000 ml
- Cách ựiều chế: Cân 20 g Agar cho vào bình tam giác (lọ thuỷ tinh), tiếp ựó cho 1000ml nước cất lắc ựều ựể tạo thành dung dịch ựồng nhất.
Môi trường PGA (Potato Dextro Agar): - Thành phần:
Khoai tây : 250 g đường Glucose : 20 g
Agar : 20 g
Nước cất : 1000 ml
Môi trường nước quả ổi
Quả ổi : 200 g
đường Glucose : 20 g
Agar : 20 g
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 Môi trường nước lá ổi
Lá ổi : 200 g
đường Glucose : 20 g
Agar : 20 g
Nước cất : 1000 ml
- Cách làm: đối với củ khoai tây, rửa sạch, gọt bỏ vỏ cắt thành từng miếng, nhỏ sau ựó cho vào xoong, cho thêm 1000ml nước cất ựun sôi trong 20 phút, gạn bọt. Sau ựó lọc qua 4 lớp vải màn lấy nước chiết khoai tây, bỏ phần bã, thêm nước cất ựể ựược thể tắch 1000ml. Cân Agar, ựường Gluco cho vào xoong ựun trên bếp nhỏ lửa vừa ựun vừa dùng ựũa thủy tinh khuấy ựều tay ựến khi nước trong xoong sôi sau ựó ựổ dung dịch trên vào các bình tam giác, dùng giấy bạc bịt nắp ngiệng bình. Xếp bình vào nồi hấp, hấp ở 121oC trong 30 phút, sau ựó ựể nguội ựến khi nhiệt ựộ trông nồi hấp xuống còn khoảng 55oC, ựưa vào buồng cấy ựã ựược khử trùng ựể bình môi trường nguội cầm tay vào bình thấy ấm là có thể ựổ ra các ựĩa Petri ựã vô trùng.
đối với môi trường nước quả ổi và nước lá ổi tiến hành làm tương tự như ựối với môi trường PGA.
Phương pháp phân lập nấm gây bệnh
Thu thập các mẫu bệnh trên quả và trên lá từ các vườn, ruộng trồng ổi trên ựịa bàn xã. Sau khi ựã rửa qua các mẫu bệnh bằng nước sạch ựể khô tự nhiên sau ựó khử trùng mẫu bệnh bằng cồn 70o. Cắt vết bệnh ựiển hình trên lá, quả (dùng dao mổ cắt miếng nhỏ bao gồm cả phần bị bệnh và phần không bị bệnh), cấy trên môi trường WA, sau 2 Ờ 3 ngày các sợi nấm sẽ mọc trên môi trường, xung quanh vết bệnh ựã cấy. Sau ựó chúng tôi tiến hành cấy chuyển tiếp bằng cách cắt ựỉnh sinh trưởng của sợi nấm trên môi trường WA cấy chuyển lên môi trường PGA. Môi trường PGA là môi trường dinh dưỡng gồm khoai tây, ựường gluco, và aga. Từ môi trường PGA cấy chuyển tiếp ựến khi thu ựược nấm thuần (trên môi trường chỉ có một loại nấm phát triển). Sau khi cấy chuyển 1 ngày xung quanh ựiểm cấy chuyển sẽ mọc các sợi nấm, sau 7 Ờ 8 ngày các sợi nấm mọc kắn ựĩa. Trong ựiều kiện nhiệt
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 ựộ 28.5o C sau khi cấy chuyển nấm ựã ựược làm thuần từ 9 Ờ 11 ngày các sợi nấm sẽ mọc kắn ựĩa ụ 9 (90mm) và sau 13 Ờ 15 ngày trên bề mặt sợi nấm sẽ xuất hiện bào tử. Sau 21 Ờ 25 ngày mọc rất nhiều ổ bào tử nấm.
Làm thuần mẫu nấm
Giai ựoạn cuối cùng trong việc giám ựịnh nấm gây bệnh là việc làm thuần mẫu nấm. Chỉ một bào tử hoặc một ựỉnh sinh trưởng của sợi nấm ựược cấy sang môi trường sạch ựể ựảm bảo nấm ựược cấy là hoàn toàn thuần.
Xác ựịnh nguyên nhân gây bệnh ghẻ hại ổi
Sau khi ựã tạo ựược nguồn nấm thuần, chúng tôi tiến hành các thắ nghiệm lây bệnh nhân tạo ngoài ựồng ruộng.
Từ các cây bị nhiễm bệnh nhân tạo hình thành triệu chứng rõ ràng, chúng tôi tiến hành phân lập lại mô bệnh trên môi trường nhân tạo (theo quy tác Kock).
Miêu tả so sánh ựặc ựiểm, hình thái và màu sắc của sợi nấm, tản nấm, bào tử nấm gây bệnh.
Dựa vào các ựặc ựiểm về hình dạng, màu sắc kắch thước bào tử ựể xác ựịnh loài nấm gây bệnh ghẻ hại ổi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt ựộ ựến sự phát triển nấm Pestalotia trên môi trường dinh dưỡng khác nhau
Thắ nghiệm ựược tiến hành với 3 môi trường dinh dưỡng khác nhau ở 2 ngưỡng nhiêt ựộ khác nhau là 18oC, 28.5oC.
Nuôi cấy nấm Pestalotia sp trên môi trường PGA
Thắ nghiệm 1: Nuôi cấy trên môi trường là PGA, nước quả ổi, nước lá ổi ở ựiều kiện nhiệt ựộ 28.5oC
Thắ nghiệm 2: Nuôi cấy trên môi trường là PGA, nước quả ổi, nước lá ổi ở ựiều kiện nhiệt ựộ 18oC.
Mỗi môi trường ựược nhắc lại 3 lần, mỗi lần tương ứng 1 ựĩa petri. - Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hình thái, màu sắc tản nấm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 + đơn vị ựo (mm)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 Khảo sát ảnh hưởng của một số loại thuốc hóa học ựến sự phát triển của
nấm ở nhiệt ựộ 28.5oC, 18oC
Thắ nghiệm sẽ ựược tiến hành với 3 loại thuốc ở 2 nồng ựộ khác nhau và ựặt ở 2 ngưỡng nhiệt ựộ khác nhau.
Các loại thuốc ựược sử dụng + Antracol 70 WP
+ Kocide 53.8DF + Sumi Eight 15.5 WP
Mỗi 1 loại thuốc sử dụng nồng ựộ là 0,01 và 0.02% Lượng thuốc cần ựể pha trên môi trường là:
Nồng ựộ 0.01%
+ Antracol 70 WP: 10mg/100ml môi trường + Kocide 53.8DF : 10mg/100ml môi trường + Sumi Eight 15.5 WP : 10mg/100ml môi trường Nồng ựộ 0.02%
+ Antracol 70 WP: 20mg/100ml môi trường + Kocide 53.8DF : 20mg/100ml môi trường + Sumi Eight 15.5 WP : 20mg/100ml môi trường
Chuẩn bị pha thuốc hóa học trên môi trường nhân tạo
Cách tiến hành: Cân lượng thuốc theo từng nồng ựộ, cho thêm 10ml nước cất vô trùng, lắc cho thuốc tan, khi môi trường PGA ựã nguội nhiệt ựộ khoảng 40 Ờ 50oC ựổ nước thuốc ựã pha vào 90ml môi trường, lắc nhẹ cho nước thuốc hòa ựều với môi trường (chú ý không ựể tạo bọt trong môi trường) sau ựó ựổ môi trường ra ựĩa petri ựường kắnh 90mm.
Chuẩn bị nguồn nấm: Nguồn nấm ựã ựược làm thuần trên môi trường dinh dưỡng.
Mỗi loại thuốc làm 2 thắ nghiệm nồng ựộ khác nhau mỗi nồng ựộ ựặt ở 3 ngưỡng nhiệt ựộ khác nhau, mỗi công thức cấy 3 ựĩa ứng với 3 lần nhắc lại. Riêng công thức ựối chứng chỉ cần cấy 1 ựĩa.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 đột nấm theo vòng tròn ựồng tâm ựể lấy ựược nấm cùng tuổi, dùng que cấy khêu nấm cấy vào giữa ựĩa petri, ghi tên thuốc, nồng ựộ, tên nấm, ngày cấy, bọc nilon quanh mép ựĩa, cho vào tủ bảo quản. Theo dõi các chỉ tiêu: đường kắnh tản nấm sau cấy 1, 3, 5, 7, 9, 11... ngày.