2. Tiến hành vi nhõn giống hoa cỳc
2.3. giai đoạn nhõn nhanh chồi
Mục đớch của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Chớnh vỡ thế giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quỏ trỡnh nuụi cấy. Để tăng hệ số người ta thường đưa vào mụi trường nuụi cấy cỏc chất điều hũa sinh trưởng (auxin, cytokinin, …), cỏc chất bổ sung khỏc như nước dừa, dịch chiết nấm mem,…, kết hợp với cỏc yếu tố ỏnh sỏng, nhiệt độ thớch hợp. Thể chồi được lấy ra khỏi mụi trường cấy ban đầu, dựng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kớch thước của chồi. Lỏt cắt được chuyển vào mụi trường nhõn nhanh thớch hợp nhất: VW + 100 mlND + 10 g đường + 30gKT + 30g CR + 1 g Pepton + 6,5g agar
Mỗi lỏt cắt sẽ phỏt triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, cú thể cắt tiếp và cấy chuyền sang mụi trường mới.
2.4. Tạo cõy hoàn chỉnh
Khi đạt đến số cõy giống cần thiết, và thể chồi đạt được kớch thước nhất định cao khoảng 2cm ta chuyển thể chồi sang mụi trường tạo rễ. Ở giai đoại này người ta bổ sung vào mụi trường nuụi cấy cỏc chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhúm auxin, là nhúm hormon thực vật quan trọng cú chức năng tạo rễ phụ từ mụ nuụi cấy. Mụi trường tạo rễ thớch hợp cho lan là:
VW+ 1g/l THT
Sau 4 - 5 thỏng, cỏc thể chồi sẽ phỏt triển thành cõy con.
2.5. Kỹ thuật đưa cõy ra vườn ươm
Đõy là giai đoạn cuối cựng của quỏ trỡnh và nú quyết định khả năng ứng dụng của quỏ trỡnh nhõn giống invitro trong thực tiễn sản xuất. Đõy là giai đoạn chuyển cõy từ mụi trường dị dưỡng sang mụi trường tự dưỡng hoàn toàn. Do đú phải đảm bảo cỏc điều kiện ngoại cảnh thớch hợp để cõy cú thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất. Giỏ thể: rong biển, 2 rong biển:1 xơ dừa. Cú thể lấy than gỗ, xơ dừa, vỏ lạc làm giỏ thển để trồng lan. Than gỗ nung cần chặt khỳc, kớch thước 1 x 2 x 3cm, than phải ngõm, rửa sạch, phơi khụ. Xơ dừa xộ cho tơi ngõm khoảng 1 tuần cho bớt tanin và mặn, phơi khụ. Mụn dừa cũng cần rửa sạch phơi khụ. Vỏ dừa chặt khỳc 1 x 2 x 3 cm xử lý bằng nước vụi 5%. Sau một thời gian cõy phỏt triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu khoảng một tuần mới được bún phõn, lỳc này cõy đó cú đủ sức chống chọi với bệnh tật. Như
vậy, từ một mụ hoa Lan được chọn nuụi cấy cho đến ra cõy con cú 3-4 lỏ chuyển ra vườn trồng mất thời gian khoảng từ 8 đến 11 thỏng.
C. Bài tập và sản phẩm thực hành của học viờn
Bài tập 1: Thực hành pha chế cỏc loại mụi trường vi nhõn giống cho hoa lan
- Cỏch thức: chia cỏc nhúm nhỏ (5 – 10 học viờn/nhúm), mỗi nhúm nhận
nhiệm vụ pha chế một loại mụi trường vi nhõn giống cho hoa lan
- Thời gian hoàn thành: 3 giờ/1 nhúm - Hỡnh thức trỡnh bày: thực hành tại chỗ
- Phương phỏp đỏnh giỏ: kỹ năng vận dụng lý thuyết vào thực hành của
mỗi học viờn trong nhúm và thỏi độ thực hành của học viờn.
- Kết quả sản phẩm cần đạt được:
+ Pha chế được mụi trường vi nhõn giống cho hoa lan theo đỳng quy trỡnh + Mụi trường sau khi pha chế đủ tiờu chuẩn để sử dụng
Bài tập 2: Thực hành nuụi cấy khởi đầu hoa lan?
- Cỏch thức: chia cỏc nhúm nhỏ (5 – 10 học viờn/nhúm), mỗi nhúm nhận
nhiệm vụ nuụi cấy khởi đầu cho 5 vảy hành
- Thời gian hoàn thành: 3 giờ/1 nhúm - Hỡnh thức trỡnh bày: thực hành tại chỗ
mỗi học viờn trong nhúm và thỏi độ thực hành của học viờn.
- Kết quả cần đạt được:
+ Chọn được vảy hành đạt tiờu chuẩn để nuụi cấy + Thực hiện nuụi cấy khởi đầu đỳng với quy trỡnh + Mẫu sau khi cấy đảm bảo tỷ lệ sống và tỷ lệ vụ trựng
Bài tập 3: Thực hành nhõn nhanh chồi hoa lan?
- Cỏch thức: chia cỏc nhúm nhỏ (5 – 10 học viờn/nhúm), mỗi nhúm nhận
nhiệm vụ cấy chuyền, nhõn nhanh 5 bỡnh mẫu
- Thời gian hoàn thành: 3 giờ/1 nhúm - Hỡnh thức trỡnh bày: thực hành tại chỗ
- Phương phỏp đỏnh giỏ: kỹ năng vận dụng lý thuyết vào thực hành của
mỗi học viờn trong nhúm và thỏi độ thực hành của học viờn.
- Kết quả cần đạt được:
+ Chọn được bỡnh mẫu đạt tiờu chuẩn để nhõn nhanh + Thực hiện nhõn nhanh chồi đỳng với quy trỡnh
+ Mẫu sau khi cấy đảm bảo hệ số nhõn, chất lượng chồi, tỷ lệ sống và tỷ lệ vụ trựng
Bài tập 4: Thực hành tạo cõy hoàn chỉnh cho chồi hoa lan nuụi cấy?
- Cỏch thức: chia cỏc nhúm nhỏ (5 – 10 học viờn/nhúm), mỗi nhúm nhận
nhiệm vụ tạo cõy hoàn chỉnh cho 5 bỡnh chồi mẫu
- Thời gian hoàn thành: 3 giờ/1 nhúm - Hỡnh thức trỡnh bày: thực hành tại chỗ
- Phương phỏp đỏnh giỏ: kỹ năng vận dụng lý thuyết vào thực hành của
mỗi học viờn trong nhúm và thỏi độ thực hành của học viờn.
- Kết quả cần đạt được:
+ Chọn được bỡnh mẫu đạt tiờu chuẩn
+ Thực hiện tạo cõy hoàn chỉnh đỳng với quy trỡnh
+ Mẫu sau khi cấy đảm bảo tỷ lệ ra rễ, số lượng rễ, chất lượng rễ, tỷ lệ sống và tỷ lệ vụ trựng
Bài tập 5: Thực hành ra cõy và chăm súc mầm hoa lan tại vườn ươm?
- Cỏch thức: chia cỏc nhúm nhỏ (5 – 10 học viờn/nhúm), mỗi nhúm nhận
nhiệm vụ ra cõy và chăm súc cho 5 bỡnh lan đó cú cõy hoàn chỉnh
- Thời gian hoàn thành: 3 giờ/1 nhúm - Hỡnh thức trỡnh bày: thực hành tại chỗ
mỗi học viờn trong nhúm và thỏi độ thực hành của học viờn.
- Kết quả cần đạt được:
+ Chọn được bỡnh cõy hoàn chỉnh đạt yờu cầu ra cõy
+ Thực hiện ra cõy và chăm súc cõy mầm ở vườn ươm đỳng với quy trỡnh + Cõy mầm sau khi ra cõy đảm bảo tỷ lệ sống và chất lượng cõy con xuất vườn
D. Ghi nhớ: Cần chỳ ý một số nội dung trọng tõm:
- Mụi trường vi nhõn giống hoa lan - Quy trỡnh vi nhõn giống hoa lan.
Bài 3: Vi nhõn giống hoa lily Mó bài: MĐ 05 – 03 Mục tiờu
- Thành thạo cỏc bước cụng việc thực hiện trỡnh tự cỏc giai đoạn vi nhõn giống cõy hoa lily theo đỳng quy trỡnh
A. Giới thiệu quy trỡnh vi nhõn giống hoa lily
Củ giống
HgCl2 0,1% ,10 phút Nguồn mẫu khởi đầu M S+1ppmBA+0,25ppm -NAA Nhân nhanh, M S+1ppmBA+0,25ppm - NAA, 6 tuần Ra rễ trên môi tr- ờng M S+0,25ppm-NAA, 4 tuần Trồng cây trong chậu Thích nghi Cây ra đất, 1thá ng M ô lá Tạ o callus M S+1ppm2,4D Tá i sinh chồi M S+2ppmBA Lớ p mỏng tế bào
B. Cỏc bƣớc tiến hành vi nhõn giống hoa lily
1. Chuẩn bị cỏc điều kiện cần thiết cho vi nhõn giống hoa lily 1.1. Chuẩn bị trang thiết bị, dụng cụ phục vụ vi nhõn giống 1.1. Chuẩn bị trang thiết bị, dụng cụ phục vụ vi nhõn giống
Đõy là bước đầu tiờn đảm bảo cho quỏ trỡnh vi nhõn giống cõy hoa được diễn ra thuận lợi. Bước này bao gồm chuẩn bị thiết bị, dụng cụ, nguyờn liệu và húa chất. * Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ:
- Nồi autoclave, tủ cấy vụ trựng - Bếp gas (bếp từ hoặc lũ vi súng)
- Nồi nấu mụi trường - Cốc thủy tinh
- Ống đong
- Ống nghiệm, chai thủy tinh - Đũa thủy tinh
- Cõn kỹ thuật
- Mỏy đo pH, giấy đo pH - Phễu, giỏ rút mụi trường - Bụng khụng thấm nước - Giấy bỏo, nilon, dõy cao su * Chuẩn bị nguyờn liệu:
- Nước cất
- Cỏc chất điều tiết sinh trưởng
- Nước dừa, cà rốt, khoai tõy, ...(cho mụi trường nhõn giống hoa lan) - Agar
- Đường glucose (hoặc saccarose)
- Cỏc loại dung dịch mẹ (đa lượng, CaCl2, vi lượng, sắt, vitamin)
1.2. Kiểm tra cỏc điều kiện cần thiết trong hệ thống phũng nuụi cấy, nhà lƣới, vƣờn ƣơm
Trước khi tiến hành cỏc thao tỏc pha chế mụi trường và vi nhõn giống cõy hoa yờu cầu: Phũng cấy, tủ cấy, dụng cụ cấy phải được khử trựng nhằm hạn chế sự xõm nhiễm nguồn tạp nhiễm vào mẫu cấy trong quỏ trỡnh vi nhõn giống.
* Phũng cấy: phải luụn sạch sẽ vỡ vậy cần:
- Quột dọn lau sạch sàn, xung quanh tường bằng nước sạch (cú thể xụng formol để khử trựng trước đú vài ngày)
- Bật quạt thụng giú, điều hũa * Tủ cấy:
- Dựng bụng thấm cồn lau sạch bờn trong, bờn ngoài tủ - Phủ màn tối kớn tủ
- Bật đốn tử ngoại, quạt trong thời gian từ 15-30 phỳt - Lấy mà che khỏi tủ
- Tắt đốn tử ngoại đợi sau thời gian 15-30 phỳt mới thực hiện cỏc thao tỏc bờn trong tủ cấy.
Lưu ý khi sử dụng đốn tử ngoại:
- Trong thời gian bật đốn tử ngoại khụng được làm việc trong phũng - Khụng được nhỡn trực tiếp vào đốn khi đang bật
- Bật, tắt đốn theo đỳng thời gian quy định mới được vào phũng làm việc
* Dụng cụ cấy: cỏc dụng cụ sử dụng trong vi nhõn giống hoa (Bỡnh tam giỏc, kộo, dao cấy cỏc loại,...) được bao gúi và khử trựng khụ ở nhiệt độ 160-1700
C trong 1,5-2 giờ hoặc hấp khử trựng hơi nước trong nồi autoclave, dụng cụ sau khử trựng phải để vào vị trớ sạch sẽ nếu chưa sử dụng ngay.
Trước khi tiến hành ra cõy vườn ươm cần xỏc định, kiểm tra cỏc điều kiện cần thiết của vươn ươm: mức độ cứng trắc của khung nhà lưới, khả năng điều chỉnh ỏnh sỏng của vật liệu làm mỏi che; ụ, khoảnh được phõn chia phải thuận tiện cho việc chăm súc cõy mầm, đặc biệt là hệ thống cung cấp nước cho vườn ươm hay nhà lưới cú thể vận hành thử để trỏnh những rủi ro, tổn thất lớn cú thể xảy ra.
Kiểm tra số lượng, chất lượng cỏc chất tham gia phối trộn làm giỏ thể ra cõy (đất, mựn, phõn bún, cỏt, trấu hun, …)
Khi sử dụng thuốc phũng trừ sõu bệnh nhớ đọc kỹ hướng dẫn sử dụng trước khi dựng, phải tuõn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
1.3. Chuẩn bị mụi trƣờng để nuụi cấy
Quỏ trỡnh vi nhõn giống hoa thường sử dụng 3 loại mụi trường chớnh là: - Mụi trường tỏi sinh
- Mụi trường nhõn nhanh
- Mụi trường tạo cõy hoàn chỉnh (mụi trường ra rễ)
Cỏc loại mụi trường này chủ yếu khỏc nhau về thành phần, hàm lượng cỏc chất điều tiết sinh trưởng, phương phỏp pha chế đều tuõn thủ theo cỏc bước sau đõy: Bước 1: Kiểm tra lại cỏc dụng cụ, nguyờn liệu
Bước 2: Căn cứ vào cụng thức của mụi trường và thể tớch cần pha tớnh toỏn toỏn thể tớch cỏc dung dịch mẹ, agar, đường, chất điều tiết sinh trưởng, cỏc phụ gia khỏc
Bước 3: Đong chớnh xỏc cỏc dung dịch mẹ vào ống đong, lờn thể tớch bằng nước cất
Bước 4: Trộn hỗn hợp cỏc dung dịch
- Đun núng hỗn hợp đó lờn thể tớch trong nồi pha chế mụi trường - Khuấy tan đường
- Khuấy cho agar hũa tan
- Bổ sung cỏc chất điều tiết sinh trưởng theo cụng thức pha chế Bước 5: Phõn phối mụi trường vào ống nghiệm hoặc chai thủy tinh
- Rút hỗn hợp mụi trường vào cốc cú miệng để dễ đổ vào ống nghiệm, chai - Dựng phễu phõn phối nhanh mụi trường và cỏc ống nghiệm: lượng mụi trường chiếm khoảng 1/7 ống nghiệm (tương đương khoảng 3-4ml/một ống nghiệm), đối với chai thủy tinh từ 10-15ml nếu đổ vào ống nghiệm thỡ phễu được cố định trờn một giỏ đỡ.
Lưu ý:
- Khi phõn mụi trường hạn chế mụi trường dớnh trờn miệng ống nghiệm, nếu bị dớnh phải lau sạch.
Bước 6. Làm nỳt bụng cho cỏc ống nghiệm, chai thủy tinh đó cú mụi trường.
- Lấy một lượng bụng vừa đủ sao cho nỳt bụng sau khi làm xong khụng quỏ chặt hay quỏ lỏng, phần nỳt bụng trong ống nghiệm, chai thủy tinh trũn đều, phần ngoài khụng bị xơ, kớch thước nỳt bụng bờn trong ống nghiệm từ 3-4cm, kớch thước bờn ngoài 2-3cm
Bước 7: Chuyển cỏc ống nghiệm hoặc bỡnh thủy tinh cú mụi trường vào nồi khử trựng
Bước 8: Khử trựng mụi trường
Cỏc ống, chai mụi trường sau khi đó được làm nỳt bụng xong được đưa vào nồi hấp khử trựng. Mục đớch để tiờu diệt hoàn toàn cỏc nguồn nhiễm tạp trong mụi trường, mụi trường sau khi hấp khử trựng xong phải đảm bảo vụ trựng tuyệt đối và khụng làm giảm chất lượng mụi trường.
Chế độ hấp khử trựng: thiết bị khử trựng thường ỏp dụng là nồi hấp autoclave ở nhiệt độ 1210C trong 30 phỳt. Sau khi quỏ trỡnh hấp thanh trựng kết thỳc, lắc đều mụi trường trước khi để cố định tại một vị trớ sạch sẽ.
2. Tiến hành vi nhõn giống hoa lily
Hoa Lily là cõy hoa mang lại lợi nhuận lớn ở nhiều nước như Hà Lan, Nhật bản…Ở Việt Nam, hoa Lily được trồng ở Đà Lạt từ thời Phỏp thuộc. Hiện nay nhu cầu về giống hoa Lily là rất lớn. Ở Đà Lạt, những người trồng hoa phải mua củ giống từ Hà Lan, giỏ hiện tại cho một củ giống từ 7000 - 10.000 đồng tuỳ loại và màu sắc, do vậy sản phẩm của hoa thương phẩm là rất đắt. Ứng dụng kỹ thuật nuụi cấy mụ tế bào cú thể chủ động sản xuất cõy giống cũng như củ giống và là phương phỏp được ỏp dụng nhiều nơi trờn thế giới. Cú thể nuụi cấy được nhiều bộ phận khỏc nhau của hoa Lily. Một trong những phương đơn giản nhất là phương phỏp nuụi cấy vảy củ.
2.1. Giai đoạn chuẩn bị
Đõy là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trỡnh nhõn giống invitro. Mục đớch của giai đoạn này là phải tạo được nguyờn liệu thực vật vụ trựng để đưa vào nuụi cấy. Mẫu đưa từ bờn ngoài vào phải đảm bảo cỏc yờu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao; tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cỏch lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuụi cấy mụ hoa lily là vảy củ được tỏch từ củ mẫu lấy của cõy lily sinh trưởng và phỏt tiển khỏe khụng bị nhiễm cỏc loại sõu bệnh. Củ được làm sạch, và khử trựng bằng cỏch ngõm trong dung dịch HgCl2 1% 10 phỳt, sau đú lấy ra và rửa bằng nước cất vụ trựng 4-5 lần trước khi tỏch lấy vảy củ cấy vào mụi trường tỏi sinh hoặc mụi trường tạo callus. Toàn bộ cỏc thao tỏc được thực hiện trong tủ cấy vụ trựng
2.2. Tỏi sinh mẫu nuụi cấy
Dựng dao cấy tỏch lần lượt cỏc vảy củ đó được khử trựng sạch cấy vào mụi trường tỏi sinh mẫu, mụi trường tỏi sinh hiệu quả nhất đối với vảy lily là MS + 1ppmBA + 0,25ppmNAA
Vảy củ cũng cú thể được nuụi cấy trong mụi trường định hướng tạo callus MS + 1ppm2,4D sản phẩm thu được cấy chuyển vào mụi trường MS + 2ppmBA để tạo chồi. Cỏch nuụi cấy thứ hai thu được lượng mẫu nhiều hơn phương phỏp tỏi sinh chồi trực tiếp ở cỏch một. Chồi thu được ở giai đoạn này sẽ là nguyờn liệu cho giai đoạn nhõn nhanh chồi tiếp theo.
2.3. Giai đoạn nhõn nhanh chồi
Mục đớch của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Chớnh vỡ thế giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quỏ trỡnh nuụi cấy. Chồi tỏi sinh lily tỏi sinh được tỏch và cấy chuyển sang mụi trường nhõn nhõn tối ưu MS + 1ppmBA + 0,25ppmNAA. Sau khoảng 6 tuần thu được cỏc cụm chồi, chồi sẽ được tỏch khỏi cụm và cấy chuyển vào mụi trường nhõn nhanh lần tiếp theo để thu được hệ số nhõn chồi cao. Số lần cấy chuyển nờn giới hạn trong 4-5 lần. Nếu số lần cấy chuyển quỏ nhiều chất lượng chồi lily sẽ giảm, xuất hiện cỏc chồi dị