3.4.2.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn từ đoạn thân cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer)
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp khử trùng đến khả
năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn từ đoạn thân cây Nhân Sâm (Panax
ginseng C.A. Meyer)
- Phương pháp tạo vật liệu vô trùng:
Mẫu cấy là các đoạn thân chứa mầm ngủ, sau khi lấy mẫu về đem vào rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bọt dưới vòi nước, tiếp tục tráng lại 3 - 4 lần bằng nước cất rồi đưa vào buồng cấy vô trùng để khử trùng.
Sau khi khử trùng xong cấy đoạn thân Nhân Sâm vào môi trường đã chuẩn bị sẵn.
Sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 22 - 250C, cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux, quang chu kì 16h sáng/8h tối, độ ẩm: 60 - 65 %. Tiến hành theo dõi mẫu (quan sát bằng mắt thường).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Thí nghiệm gồm 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 30 bình, mỗi bình cấy một mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
+ CT1: Nhúng mẫu vào cồn 96% hơ trên ngọn lửa đèn cồn 30 giây + CT2: Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút
+ CT3: Khử trùng bằng cồn 70% (trong 30 giây) kết hợp với HgCl2 0,1% (trong 7 phút).
Chỉ tiêu theo dõi: Tiến hành theo dõi sau 7 ngày các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu sống không nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ mẫu chết.
3.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5 và WPM
đến khả năng tái sinh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer)
- Phương pháp tái sinh in vitro:
Sử dụng môi trường MS, B5, WPM có bổ sung Inositol 100mg/l + đường
30g/l + agar 5,0 g/l, pH: 5,6 - 5,8.
Chồi được cấy trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ phòng từ 22 - 250
cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux, quang chu kì 16h sáng/8h tối, độ ẩm 60
- 65% . Tiến hành theo dõi số chồi, chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5 và WPM
đến khả năng tái sinh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer)
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình, mỗi bình cấy một mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
CT Môi trường
1(Đ/C) MS
2 B5
3 WPM
Chỉ tiêu theo dõi sau 20 ngày: Tỷ lệ tái sinh, chất lượng chồi.
Chú ý: Trong các công thức có bổ sung Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar
5g/l, pH: 5,6 - 5,8.
3.4.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và nước dừa tới khả năng nhân nhanh của chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sử dụng môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin, nước dừa vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm.
Sử dụng dao đã được khử trùng tách chồi đã tái sinh từ đoạn thân.
Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt có chiều dài từ 0,5 - 1cm, dùng pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi đưa vào môi trường đã được chuẩn bị trước.
Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi.
Sau 30 ngày tiến hành theo dõi số chồi, hệ số nhân và chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng
nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer)
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Thí nghiệm có 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy
10 bình, mỗi bình cấy một mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Hóa chất CT Nồng độ (mg/l) BA 1(Đ/C) 0,0 2 0,05 3 0,1 4 0,5 5 1,0
MT nền = Môi trường tái sinh chồi tốt nhất ở thí nghiệm 2 (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) có bổ sung thêm Inositol 100mg/l + đường 30g/l +
agar 5g/l, pH = 5,6 - 5,8.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả
năng nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer)
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Thí nghiệm có 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy một mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Hóa chất CT Nồng độ (mg/l) Kinetin 1(Đ/C) 0,0 2 0,5 3 1,0 4 1,5
MT nền = Môi trường tái sinh chồi tốt nhất ở thí nghiệm 2 (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) có bổ sung thêm Inositol 100mg/l + đường 30g/l +
Nồng độ cytokinin thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi Nhân Sâm xác định ở thí nghiệm 3 và 4 (ký hiệu A) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cytokinin (A) kết hợp với các nồng độ IBA, NAA và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer)
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Thí nghiệm có 15 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy một mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Hóa chất CT Nồng độ (mg/l) IBA 1(Đ/C) Nền + A + 0,0 2 Nền + A + 0,05 3 Nền + A + 0,1 4 Nền + A + 0,5 5 Nền + A + 1,0 NAA 1(Đ/C) Nền + A + 0,0 2 Nền + A + 0,05 3 Nền + A + 0,1 4 Nền + A + 0,5 5 Nền + A + 1,0 IAA 1(Đ/C) Nền + A + 0,0 2 Nền + A + 0,05 3 Nền + A + 0,1 4 Nền + A + 0,5 5 Nền + A + 1,0
MT nền = Môi trường tái sinh chồi tốt nhất ở thí nghiệm 2 (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) có bổ sung thêm Inositol 100mg/l + đường 30g/l +
agar 5g/l, pH = 5,6 - 5,8.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của của hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer)
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Thí nghiệm có 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy một mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Công thức (CT) Hàm lượng nước dừa (ml/l) 1(Đ/C) Nền + 0,0 2 Nền + 50 3 Nền + 100 4 Nền + 150 5 Nền + 200
MT nền = Môi trường tái sinh chồi tốt nhất ở thí nghiệm 2 (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) có bổ sung thêm Inositol 100mg/l + đường 30g/l +
agar 5g/l, pH = 5,6 - 5,8.
3.4.2.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt
tính đến khả năng ra rễ của chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lựa chọn chồi Nhân Sâm mập có từ 3 - 4 lá chuyển sang môi trường ra rễ. Môi trường ra rễ dựa trên môi trường MS có bổ sung các nồng độ NAA khác nhau để kích thích tạo rễ, hình thành cây con hoàn chỉnh.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt
tính đến khả năng ra rễ của chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer)
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Thí nghiệm có 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy một mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
CT1: Nền + NAA 0,0 mg/l CT2: Nền + NAA 0,1 mg/l CT3: Nền + NAA 0,5 mg/l CT4: Nền + NAA 1,0 mg/l CT5: Nền + THT 2,0 g/l
Chỉ tiêu theo dõi: Số rễ/cây, chất lượng rễ, chiều dài rễ (cm)
Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) có bổ sung thêm Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l, pH = 5,6 - 5,8.
3.4.2.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thểđến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ở
giai đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm
Sau khi chồi đạt tiêu chuẩn với chiều cao khoảng 3 - 4cm, có từ 4 - 5 lá thật, 3 - 4 rễ trở lên đưa cây ra ngoài vườn ươm.
Việc chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện tự nhiên bên ngoài vườn ươm là giai đoạn rất quan trọng. Trong giai đoạn này, sự thay đổi đột ngột điều kiện sống, từ môi trường dị dưỡng ra môi trường tự dưỡng hoàn toàn đòi hỏi cây phải có quá trình thích nghi. Sự thành công của giai đoạn này góp phần quan trọng cho sự thành công của phương pháp nhân giống.
Để cho cây có quá trình thích nghi với môi trường sống ngoài tự nhiên tốt, cây cần được huấn luyện trước khi đưa ra giá thể phù hợp. Việc lựa chọn giá thể thích hợp là một việc rất quan trọng.
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ở giai
đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại trồng 20 cây. Cây được trồng vào các loại giá thể khác nhau như sau:
Công thức Giá thể
1 (ĐC) Trấu hun + Sơ dừa (1:1) 2 Mùn cưa (cây không chứa tinh dầu)
3 Đất
4 Cát
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Tỷ lệ cây sống, tỷ lệ cây chết, chất lượng cây con.
3.4.2.6. Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá
- Tỷ lệ mẫu sống nhiễm: Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm: Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = Tổng số mẫu sống (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Tỷ lệ mẫu chết: Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Tỷ lệ tái sinh: Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = Tổng số mẫu tái sinh (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Hệ số nhân:
Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi (chồi) Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu)
Chất lượng chồi bật: + Chồi mập, chồi nhỏ
+ Màu sắc chồi: Chồi xanh, xanh nhạt
- Số rễ trung bình/cây:
Số rễ trung bình/cây (rễ) =
Tổng số rễ ra (rễ) Tổng số mẫu cấy (mẫu) Chất lượng rễ: + Mập, nhỏ + Dài, ngắn - Tỷ lệ cây sống: Tỷ lệ cây sống (%) = Tổng số cây sống (cây) x 100% Tổng số cây ban đầu (cây)
- Tỷ lệ cây chết:
Tỷ lệ cây chết (%) = (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổng số cây chết (cây)
x 100% Tổng số cây ban đầu (cây)
Chất lượng cây con (tình trạng, màu sắc)
3.4.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
- Các số liệu được tính toán bằng phần mềm Excel 2003.
- Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính theo chương trình
IRRISTART 4.0.
- Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (Least Significant Different) ở độ tin cậy 95%.
- Kiểm tra độ biến động của các thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%.
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Kết quả ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn từ đoạn thân cây Nhân Sâm (Panax