a) Môi trường nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí (HKTS)(API RP 38) (g/l)
1. NH4NO3 2 2. KH2PO4 1 3. NaCl 0 4. KCl 0,25 5. MgCl2 1,2 6. Glucose 1 7. Pepton 5 8. Cao men 0,2 9. Cao thịt 3 10. Thạch 20 11. Nước cất 1000 ml 12. pH = 7
31
b) Môi trường khoáng cải tiến dùng cho vi khuẩn tạo CHHBMSH (g/l) [31]
1. NH4NO3 4 2. Na2HPO4 4 3. KH2PO4 4 4. MgSO4 0,2 5. MnSO4 0,002 6. CaCl2 0,002 7. CuSO4 0,002 8. FeSO4 0,002 9. Glycerol 2% (v/v) 10.pH 7
Môi trường được khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút . 2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn
Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc vi khuẩn tạo CHHBM trên môi trường thạch
Môi trường thạch HKTS sau khi được khử trùng trong các bình tam giác được đổ ra đĩa petri vô trùng (mỗi đĩa đổ khoảng 25ml) sau đó cất trong tủ ấm trong vòng 24h kiểm tra mức độ vô trùng. Những đĩa không xuất hiện vi khuẩn sau 24 giờ được coi là sạch và sử dụng để để phân lập.
Các mẫu được pha loãng ở các nồng độ khác nhau bằng dung dịch muối sinh lý 0,85%. Lấy 0,5 ml mẫu cho vào 4,5 nước muối sinh lý được độ pha loãng 10-1. Tùy theo mật độ vi sinh vật mà ta tiếp tục pha loãng đến 10-3, 10-4... với cách như trên.
Hút 0,1 ml dung dịch ở nồng độ pha loãng cuối cùng nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường đã khử trùng, dùng que thủy tinh vô trùng dàn đều dung dịch trên mặt thạch.
32
Nuôi tất cả các đĩa đã cấy ở 300C đối với vi khuẩn nhiệt độ thường trong vòng 1-2 ngày. Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật.
Khi vi khuẩn đã phát triển trên các đĩa thạch, tiến hành mô tả đặc điểm hình thái của các khuẩn lạc, những khuẩn lạc riêng rẽ cấy chuyển vô trùng sang các ống thạch nghiêng HKTS. Sau khi cấy, ống thạch được nuôi cấy trong tủ ấm 30oC. Sau 24 giờ phát triển, các chủng vi khuẩn sạch trong các ống nghiệm được giữ ở nhiệt độ 4oC.
2.2.2. Phương pháp xác định Gram của vi khuẩn
Phương pháp nhuộm Gram (Phương pháp Hucker cải tiến)
Làm tiêu bản vết bôi với chủng vi khuẩn thuần khiết sau 24 giờ nuôi cấy. Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch tím kết tinh (crystal violet) trong 30 giây – 1 phút, rửa bằng nước cất với dòng chảy nhẹ. Cố định tiêu bản bằng dung dịch KI trong 1 phút, rửa bằng nước cất với dòng chảy nhẹ và thấm khô. Rửa tiêu bản bằng cồn trong 30 giây cho đến khi vết bôi vừa mất màu. Nhuộm màu bổ sung bằng safranin trong 1 – 2 phút, rửa nhẹ bằng nước cất, để khô tự nhiên, soi kính, nếu vi khuẩn bắt màu xanh tím là Gram dương, màu hồng là Gram âm. Quan sát tế bào dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần.
2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học
Sử dụng tiêu bản vết bôi trong quá trình nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào hoặc làm tiêu bản vết bôi mới nhuộm với dung dịch tím kết tinh (crystal violet) trong 1 – 2 phút và quan sát bằng vật kính dầu với độ phóng đại 1000 lần.
2.2.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM - Scanning Electron Microscope) quét (SEM - Scanning Electron Microscope)
Sử dụng que cấy Pasteur vô trùng lấy 1-2 vòng que cấy vi khuẩn vào 1ml
33
Li tâm 4000 v/ph trong 5 phút, hút bỏ pha trên, thu sinh khối. Bổ sung 0,5ml dung dịch cố định mẫu glutaraldehyde 2,5% và trộn đều bằng pipet. Chuẩn bị lamen vô trùng rửa axit và cồn, sau đó trải polylizin 1% lên để làm đệm bám dính vi khuẩn.
Trộn đều dung dịch đã cố định trên và trải đều các lớp mỏng trên lamen đã có polylizin, không để tạo bọt, để khô trong 15 phút đến khi bề mặt se hẳn (tránh để quá khô). Dùng dung dịch rửa PBS hoặc cacohydrate 0,1M để rửa các mẫu lamen, ngâm trong 5 phút, lặp lại 2 lần bước này và để khô. Tiếp tục sử dụng dung dịch cố định khác là OsO4 1% để cố định lại mẫu sau khi đã rửa trong 10 – 15 phút. Rửa lại mẫu sau khi cố định bằng 5 dung dịch cồn với nồng độ khác nhau 50%, 70%, 80%, 90% và 100% trong 5 phút, riêng dung dịch cồn 100% lặp lại 2 lần. Để khô, phủ ion mẫu, đưa lên kính SEM quan sát và chụp ảnh mẫu.
2.2.5. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn tạo CHHBSMH trên môi trường khoáng
Hai tư chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường khoáng Cooper D. G [31] có bổ sung nguồn cơ chất carbon là 2g/l glucose và nuôi lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở 30oC. Theo dõi sự phát triển và tạo CHHBMSH của vi khuẩn liên tục trong 5 ngày.
2.2.6. Phương pháp đánh giá khả năng sinh tổng hợp CHHBMSH của các chủng vi khuẩn phân lập thông qua chỉ số nhũ hoá E24 [30] chủng vi khuẩn phân lập thông qua chỉ số nhũ hoá E24 [30]
Chỉ số nhũ hoá E24 đặc trưng cho khả năng nhũ hoá của CHHBMSH do vi khuẩn tạo ra trong dung môi xylen sau 24 giờ trong 4oC.
Cách tiến hành: Hoà trộn 1ml dịch nuôi cấy có chứa CHHBMSH với 1ml xylen trong ống nghiệm 11ml. Trộn đều bằng máy voltex ở tốc độ 2000 vòng trong 2 phút. Hỗn hợp trên được để lạnh trong 4oC, đo chỉ số nhũ hoá sau 24 giờ.
Chỉ số nhũ hoá được tính theo công thức:
E24 =
Chiều cao cột nhũ hoá Chiều cao tổng số
34
Chỉ số nhũ hoá cao, chứng tỏ lượng CHHBMSH do vi khuẩn nghiên cứu tạo ra càng lớn.
2.2.7. Đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn dựa vào phương pháp đo độ đục của dung dịch nuôi cấy ( OD) đục của dung dịch nuôi cấy ( OD)
Số lượng tế bào vi sinh vật trong môi trường có thể được xác định một cách gián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ quang. Theo phương pháp này, số lượng photon ánh sáng bị phân tán tỉ lệ thuận với lượng sinh khối tế bào có trong mẫu đem đo (trừ những mẫu có tế bào đậm đặc ), hay trong những điều kiện sinh trưởng nhất định thì tỉ lệ với mật độ tế bào.
Nếu mật độ tế bào quá cao, photon ánh sáng có thể bị một tế bào nào đó làm lệch hướng khỏi bộ tụ quang điện và quay trở lại bởi một tế bào khác, do đó làm mất độ chính xác của độ hấp thu, đặc biệt là các giá trị hấp thu ở bước sóng 600nm lớn hơn 0,7. Vì vậy khi xác định mật độ tế bào bằng máy đo mật độ quang, dịch huyền phù tế bào cần phải pha loãng đến những nồng độ thích hợp để có được độ hấp thụ chính xác. Kết quả cuối cùng bằng giá trị đo được nhân với hệ số pha loãng.
2.2.8. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH
Lựa chọn nguồn cacbon: Để lựa chọn nguồn carbon và hàm lượng phù hợp cho khả năng tạo CHHBMSH, chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường khoáng có bổ sung các nguồn carbon khác nhau: glucose, dầu Diesel ( DO), Na2CO3, dầu đậu nành, dầu olive và glycerol
Lựa chọn nguồn nitơ: Để lựa chọn nguồn nitơ phù hợp cho khả năng tạo CHHBMSH, chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường khoáng có bổ sung các nguồn nitơ khác nhau: NH4NO3, (NH4)2SO4. KNO3, NaNO3 và Urea.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Khả năng tạo CHHBMSH của chủng vi khuẩn lựa chọn được đánh giá ở nhiệt độ 25, 30, 37 và 42oC
35
Ảnh hưởng của pH: Khả năng tạo CHHBMSH của chủng vi khuẩn lựa chọn được đánh giá trong dải pH 4÷11.
2.2.9. Lên men, tách chiết và tinh sạch CHHBMSH
Chủng nghiên cứu được lên men (1 lít) trên môi trường khoáng tối ưu bổ sung 2% Glycerol (v/v), 2g urea/l, ở 37oC, pH = 7 sau 3 ngày , CHHBMSH được tách chiết từ dịch lên men như sau:
Dịch lên men được ly tâm để loại bỏ tế bào. Sau khi loại bỏ hết tế bào, dịch còn lại được chỉnh xuống pH 2 bằng HCl đặc rồi để ở 4oC qua đêm đến khi kết tủa hoàn toàn. Sau đó, dịch kết tủa được ly tâm để thu hồi CHHBMSH (dạng cặn). CHHBMSH được làm khô bằng speedvac nhẹ. CHHBMSH thô được làm kiềm hóa bằng dung dịch NaHCO3 0,1 M (pH 7,5). Sau khi ly tâm, kết tủa (CHHBMSH thô) được chiết bằng dung dịch chloroform: ethanol (2:1) với tỷ lệ 1:1 (v/v). Lắc đảo đều dịch chiết trong 10 phút, thu dịch pha trên bằng phễu chiết. Lặp lại bước chiết 03 lần. Làm khô sản phẩm bằng thiết bị cô quay chân không.
2.2.10. Loại Cd và Pb từ đất ô nhiễm bằng CHHBMSH
* Chuẩn bị đất nhiễm Cd và Pb
Mẫu đất được sấy khô 105oC cho tới trọng lượng không đổi ( 2 giờ), sau khi loại hết đá và tạp chất rồi nghiền nhỏ và sàng qua rây với kích thước lỗ là 0,45 µm. Đất sau khi sấy khô và sàng được làm nhiễm Cd2+ và Pb2+ bằng dung dịch muối 3CdSO4.8H2O và Pb(NO3)2 sao cho hàm lượng cuối cùng là 300 mg Cd /kg và 1000 mg Pb/kg đất. Mẫu đất sau khi nhiễm kim loại được làm khô ở 105oC cho tới khi trọng lượng không
đổi (2 giờ) để sử dụng cho thí nghiệm loại Cd và Pb tiếp theo.
* Quy trình loại Cd và Pb từ đất bằng CHHBMSH
Thí nghiệm loại Cd và Pb từ đất bằng CHHBMSH tạo bởi chủng vi khuẩn CB5a được tiến hành trong bình tam giác có dung tích là 250 ml. 10g đất nhiễm Cd và Pb
36
được lắc trong bình tam giác chứa 50 ml dịch chứa CHHBMSH. Để đánh giá khả năng loại kim loại cơ học, tiến hành lắc mẫu đối chứng bổ sung 10g đất nhiễm kim loại được lắc với 50 ml nước khử ion cùng với mẫu thí nghiệm. Tất cả các mẫu được lắc ở 37oC, 180 vòng/phút trong vòng 3 ngày rồi ly tâm. Sau khi ly tâm mẫu đất được sấy khô 105oC trong 2 giờ. Hàm lượng Cd và Pb tổng số trong pha đất và nước được phân tích bằng phương pháp phổ phát xạ plasma dòng cao tần ICP-OES tại phòng hóa phân tích Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
* Quy trình phân hủy mẫu để xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp ICP-OES
Cân 1g mẫu đất cho vào ống Teflon (ống phân hủy mẫu) sau đó bổ sung 10 ml dung dịch axit HNO3. Lắc đều trong 2 phút rồi đậy kín nắp ống phân hủy, sau đó đưa vào lò vi sóng để phân hủy mẫu. Chương trình phân hủy mẫu được cài đặt theo điều kiện 150oC, 50 atm trong thời gian từ 25 đến 30 phút. Mẫu sau khi đã phân hủy được để nguội ở nhiệt độ phòng. Dung dịch sau khi để nguội được định mức lên 25 ml bằng nước cất 2 lần và được phân tích bằng phương pháp ICP-OES, model iCPA 6000, hãng Thermo Scientific (Anh).
2.2.11. Phương pháp phân loại chủng vi khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA
Gen mã hóa 16S rDNA của chủng vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi 27F (5’ AGA GTT TAG TCC TGG CTC AG 3’) và 1492R (5’ GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3’) theo chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 55oC trong 60 giây, 72oC trong 90 giây), 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC. Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tích
trên máy đọc trình tự ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả giải trình tự gen hai chiều được kiểm tra bằng
37
phần mềm phân tích DNA STAR (Lasergene Inc., Madison, WI, Mỹ). Mức độ tương đồng gen 16S rDNA của chủng nghiên cứu được so sánh với các trình tự gen 16S rDNA trong Genbank bằng công cụ BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
38
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm gram các chủng vi khuẩn Hai tư (24) chủng vi khuẩn nghiên cứu được hoạt hóa và nuôi cấy trên môi Hai tư (24) chủng vi khuẩn nghiên cứu được hoạt hóa và nuôi cấy trên môi trường thạch hiếu khí tổng số (HKTS) ở 30oC để quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, đặc điểm sinh hóa sinh lý và kiểm tra độ tinh sạch. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, đáp ứng thuốc nhuộm Gram của các chủng nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3.1:
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 24 chủng vi khuẩn nghiên cứu
STT Tên
mẫu Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Đặc điểm hình thái tế bào
Gram
1
ĐM2 Hình không đều lan dẹt, mép răng cưa, màu đục
ngả cam, d = 0,7-1 cm Hình que
+
2
ĐM3 Tròn lồi, bóng ướt, mép gọn,mép trong có tâm
màu cam nhạt,2 mm Hình que dài
+ 3 ĐM4 Tròn, mép răng cưa, dẹt, màu trắng sữa, 1cm Hình que + 4 ĐM5 Hìnhkhông đều, bề mặt phẳng, khô, có hạt liti
trên bề mặt, trắng ngà, 1cm Hình que
+
5 ĐM6 Tròn, lồi, bóng ướt, mép răng cưa, màu cam
nhạt, 1,5 cm Hình dấu phẩy
+
6 ĐM8 Tròn, dạng đồng tâm,mép hình tia, tâm lõm, màu
vàng chanh nhạt, 4mm Hình que ngắn
+ 7 ĐM9 Tròn, lồi, bóng ướt, mép gọn, màu trong, 1mm Hình que - 8 ĐM10 Tròn, có vòng đồng tâm, trắng đục, 3mm Hình que + 9 ĐM11 Tròn, mép gọn, bóng, có tâm đục ngả cam, mép trong, 7mm Hình oval dài, xếp đôi, xếp ba + 10 ĐM12 Tròn, bóng, ướt, mép gọn, màu đục ngả vàng, Hình oval +
39 7mm
11 ĐM13 Hình không đều, mép răng cưa, bề mặt phẳng,
bóng, màu trắng sữa, 1,7cm Hình que
+ 12 ĐM14 Tròn, mép gọn, bề mặt ghồ ghề, trắng đục, 4mm Hình que ngắn + 13 ĐM15 Khuẩn lạc lan dẹt, bề mặt phẳng, mép dạng tia,
trắng đục, 1cm Hình que dài
-
14 ĐM18 Tròn, lồi, bóng ướt, mép gọn, vàng, 1mm Hình cầu, xếp chuỗi
+
15 ĐM19 Tròn, lồi, bóng ướt, mép gọn, màu trắng ngà,
1mm Hình que ngắn
-
16 ĐM21 Mép lượn sóng, bề mặt phẳng, màu trắng sữa,
1,5 mm Hình que mảnh
+
17 ĐM23 Tròn lồi, bóng ướt, mép gọn, màu vàng chanh nhạt, 1mm
Hình que mảnh dài
+
18 ĐM24 Tròn lồi, bóng ướt, trong màu thạch, 2,5mm Hình que ngắn - 19 ĐM26 Hình dạng không đều, mép dạng múi, bề mặt khô
sần sùi, màu trắng sữa, 1cm Hình que ngắn
+
20 ĐM27 Hình không đều, bề mặt sần sùi, màu trắng ngà,
6mm Hình que ngắn
-
21 ĐM28 Tròn, mép gọn, lồi, bóng ướt, mép màu vàng chanh, 2mm
Hình cầu, xếp chuỗi.
+
22 ĐM29 Tròn, mép gọn màu trắng trong, bề mặt sần sùi,
tâm trăng sữa, 5mm Hình dấu phẩy
+
23 ĐM30 Tròn, mép gọn, có vòng tròn đồng tâm, màu trắng trong, tâm hơi đục, 2mm
Hình que ngắn -
24 CB5a
Hình không đều, mép lan, màu xanh dương, để lâu chuyển màu nâu, bề mặt bóng ướt, dẹt,
0,6mm
Hình que dài, kết đôi, ba
40
Kết quả mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 24 chủng vi khuẩn nghiên cứu cho thấy các chủng này có màu sắc đa dạng: màu trắng tinh, trắng đục, trắng ngà, trắng ngả nâu, xanh dương, vàng nhạt, vàng ngả nâu... Kích thước khuẩn lạc cũng dao động rất lớn, từ 1mm đến hơn 1cm. Đặc điểm tế bào chủ yếu là hình que, hình oval, hình cầu, đơn lẻ, kết đôi, ba hoặc kết chuỗi.
3.2. Khả năng tạo CHHBMSH của các chủng vi khuẩn
Khả năng tạo CHHBMSH của các chủng nghiên cứu trên môi trường khoáng, được xác định qua sự sinh trưởng của vi khuẩn thông qua xác định mật độ tế bào (giá trị đo OD tại bước sóng 600 nm) và chỉ số nhũ hóa E24. Kết quả được nêu trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH của các chủng vi khuẩn nghiên
cứu STT Tên chủng OD (600nm) E24 (%) 1 ĐM3 3.816 42.6 2 ĐM4 2.868 34 3 ĐM5 1.123 28.5 4 ĐM6 6.423 44 5 ĐM8 0.511 0 6 ĐM9 1.268 16 7 ĐM11 1.821 40 8 ĐM12 3.806 46.6 9 ĐM13 1.268 11.5 10 ĐM14 5.648 40.2
41 11 ĐM15 5.627 11.5 12 ĐM19 6.947 42.3 13 ĐM21 3.727 0 14 ĐM23 0.625 0 15 ĐM24 3.672 41.6 16 ĐM26 3.638 40 17 CB5a 4,02 56,8
Khả năng tạo CHHBMSH của các chủng vi khuẩn nghiên cứu đã được đánh giá