* Nguyên tắc xử lý mẫu [12]
Xử lý mẫu là quá trình hoà tan và phá huỷ cấu trúc của chất mẫu ban đầu, giải phóng và chuyển các chất cần xác định về dạng đồng thể phù hợp với phép đo đã chọn, từ đó xác định hàm lƣợng chất mà chúng ta mong muốn.
Để chuyển chất phân tắch về dạng vô cơ phù hợp với phƣơng pháp phân tắch, có hai phƣơng pháp phổ biến hiện nay là xử lý ƣớt và xử lý khô:
Kỹ thuật xử lý ƣớt: là kỹ thuật dùng các axit mạnh (hỗn hợp axit) đặc, nóng hoặc kiềm (hỗn hợp kiềm) mạnh đặc, nóng... để phân huỷ mẫu trong điều kiện đun nóng trong bình Kendan, trong hộp kắn hay trong lò vi sóng.
Kỹ thuật xử lý khô: là kỹ thuật nung để xử lý mẫu trong lò nung ở nhiệt độ thắch hợp (4500C - 7000C), sau đó hoà tan bã mẫu bằng dung dịch muối
hay axit phù hợp. Khi nung, các chất hữu cơ của mẫu sẽ bị đốt cháy hoàn toàn thành CO2 và H2O.
Có thể kết hợp hai phƣơng pháp ta có phƣơng pháp khô- ƣớt kết hợp. * Phá mẫu hệ hở
Phƣơng pháp này đơn giản, không cần dụng cụ phức tạp và cho kết quả khá chắnh xác.
Các axit đƣợc sử dụng trong phá mẫu hệ hở nhƣ: HF, HCl, H2SO4, HClO4Ầ, tùy theo loại mẫu và nguyên tố cần phân tắch mà ta có quy trình phân tắch phù hợp. Vắ dụ nhƣ để xác định các nguyên tố dễ bay hơi nhƣ Hg thì cần khống chế nhiệt độ < 1200C, để phá các mẫu chứa nhiều SiO2 cần cho thêm HFẦ.
Lê Thị Mùi [23] đã vô cơ hóa mẫu động vật nhuyễn thể bằng hỗn hợp HClO4 đặc, HNO3đ và H2O2. Sau đó xác định Cu và Pb bằng phƣơng pháp Von-Ampe hòa tan xung vi phân cho kết quả hàm lƣợng các kim loại là 1,13-2,12 μg/g Cu và 7,15-16,25 μg/g Pb.
Mohamed Maanan [61] đã phá mẫu động vật thân mềm bằng HNO3đặc để xác định hàm lƣợng các kim loại nặng. Sau đó sử dụng phƣơng pháp AAS cho kết quả hàm lƣợng các kim loại nhƣ sau: 7,2 mg.kg−1 với Cd, 26,8 mg.kg−1 với Cu 8,0 mg.g−1 với Cr 292 mg.kg−1 với Zn 20,8 mg.kg−1 với Mn và 32,8 mg.kg−1 với Ni.
Theo Arias Sari [37] năm 2002, cân 0,5g mẫu ốc đã xay mịn, sấy khô trên cân phân tắch có độ chắnh xác 0,0001g chuyển vào bình Keldan. Thêm 5 ml axit HNO3
đặc đun nóng tới 70 Ờ 90 oC tới khi mẫu tan hết thành dung dịch có màu vàng. Tăng dần nhiệt độ tới 135 oC rồi nhỏ từng giọt H2O2 vào để oxy hóa mẫu. Sau đó để nguội mẫu chuyển ra cốc cô cạn đến muối ẩm, hòa tan muối ẩm, lọc bỏ cặn silicat, định mức thành 50 ml dung dịch bằng dung dịch HNO3 2%.
Trong bài báo EU. 2001 [47], tác giả cân 0,5g mẫu ốc đã xay mịn, sấy khô trên cân phân tắch có độ chắnh xác 0,0001g chuyển vào bình Kendal 250 ml có cắm phễu lọc nhỏ. Thêm 5 ml axit HNO3 đặc đun cách cát (nhiệt độ khoảng 200 oC )
trong 3h, để nguội thêm 2 ml H2O2 đặc và 1 ml HClO4 1:1 đun tiếp đến khi mẫu tan hết đƣợc dung dịch có màu vàng. Sau đó thêm từng lƣợng nhỏ H2O2 để loại bỏ bớt axit dƣ và đuổi khắ NO2 đƣợc dung dịch trong suốt. Cuối cùng cô cạn đến muối ẩm, hòa tan muối ẩm, lọc bỏ cặn silicat, đem định mức thành 50 ml dung dịch mẫu bằng dung dịch HNO3 2%.
Jonh R. Déan [54] cân 0,5g mẫu ốc đã xay mịn, sấy khô trên cân phân tắch có độ chắnh xác 0,0001g chuyển vào bình Kendal 250 ml có cắm phễu lọc nhỏ. Thêm 3 ml axit HNO3 đặc đun ở 95 oC trong 1h, để nguội thêm 1 ml axit H2SO4 đặc đun ở nhiệt độ 140 oC trong 30 phút. Sau đó để nguội, thêm tiếp 2 ml HNO3 đặc đun ở nhiệt độ 200
oC cho tới khi mẫu tan hết. Thêm 3 ml H2O2 đun tiếp ở 200 oC đuổi hết khói mầu nâu (NO2), để nguội thêm 10 ml H2O, 1 ml H2O2 đun ở nhiệt độ 240 oC cho tới khi khói trắng xuất hiện, để nguội đem lọc bỏ cặn silicat, định mức thành 50ml dung dịch mẫu bằng axit HNO3 2 %.
Tác giả Locatelli [57] đã dùng hỗn hợp H2SO4 và HNO3 phân hủy mẫu trai, ốc, cá để xác định các vết kim loại. Để xác định Hg bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử hóa hơi lạnh (CV Ờ AAS) hỗn hợp H2SO4 và K2Cr2O7 đƣợc sử dụng.
* Phá mẫu hệ kắn bằng lò vi sóng
Hiện nay phổ biến nhất là kỹ thuật xử lý mẫu ƣớt với axit đặc trong lò vi sóng hệ kắn do có nhiều ƣu điểm nhƣ: thời gian xử lý mẫu ngắn, phá huỷ mẫu triệt để và không mất chất phân tắch, hiệu suất xử lý mẫu cao.
Dƣới tác dụng phá hủy và hoà tan các hạt (phần tử) mẫu của axit, năng lƣợng nhiệt cùng axit làm tan rã các hạt mẫu đồng thời do khuếch tán, đối lƣu, chuyển động nhiệt và va chạm của các hạt mẫu với nhau làm chúng bị bào mòn dần, các tác nhân này tấn công và bào mòn dần các hạt mẫu từ bên ngoài vào, làm cho các hạt mẫu bị mòn dần và tan hết.
Ngoài ra, trong lò vi sóng còn có sự phá vỡ từ trong lòng hạt mẫu do các phân tử nƣớc hấp thụ (> 90%) năng lƣợng vi sóng và do có động năng lớn nên chúng chuyển động nhiệt rất mạnh, làm căng và xé các hạt mẫu từ trong
ra. Hơn nữa, do xử lý mẫu trong hệ kắn nên áp suất cao sẽ làm nhiệt độ sôi cao hơn, đây là tác nhân phân huỷ mạnh nhất do vậy thúc đẩy quá trình phân huỷ mẫu từ bên trong ra và từ ngoài vào. Do đó, xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian rất ngắn 50 đến 90 phút và rất triệt để.
Các tác giả JoseƠ Usero, JoseƠ Morillo , Ignacio Gracia [53] mẫu trai sau khi lấy về đƣợc ngâm 24 giờ. Các bộ phận cơ thể khác nhau của 30 mẫu độc lập tại khu vực đƣợc tách bằng dao plastic, sau đó chúng đông khô và đồng nhất mẫu đến mịn bằng cối trƣớc khi đem phân tắch. Mẫu đƣợc phân huỷ trong lò vi sóng bằng axit HNO3.
Để phân hủy mẫu động vật nhuyễn thể, tác giải Sari Arias [36] thêm 2 ml HNO3 và 0,5 ml H2O2 vào 1 g mẫu khô rồi tiến hành phân hủy mẫu trong lò vi sóng.
K.M.Khalifa, A.M.Hamil, A.Q.A.Al-Houni, M.A.Ackacha [55] dùng HNO3 và H2O2 (1:1) phá mẫu cá trong là vi sóng sau đó định mức 50ml nằng HNO3 6%. Sử dụng ICP Ờ MS xác định Co, Cd, Pb, Fe, Cu trong cá thu đƣợc Co 0,570 Ờ 44,693 mg/kg; Cd 0,328 Ờ 2,929 mg/kg; Pb 0,246 Ờ 2,386 mg/kg. Các tác giả P.Raaj, S.Veerasingam, G.Suresh, Marichamy và R. Venkatachalapathy [74] đã dùng 5ml HNO3 + 0,5 ml HClO4 phá mẫu cá ở Ấn Độ. Thu đƣợc kết quả Cr 0,65Ờ0,92; Cd 0,18 -0,54; Cu 0,12Ờ0,31; Fe 24,1Ờ50,3; Mg 0,54Ờ1,21; Mn 0,31Ờ1,20; Ni 0,38Ờ1,54; Co 0,05Ờ0,28; Zn 14, Ờ33,5 và Al 14,1-33,5 mg/kg.
Waquar Ashraf [76] phá mẫu cá ở Saudi Arabia bằng HNO3 đặc rồi định mức bằng HNO3 1%. Xác định đƣợc Pb 0,53; Cd 0,16; Hg 0,31; Ni 0,23; Cu 0,27; Cr 0,38 mg/kg.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Mục tiêu, dối tƣợng, phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu các quy trình xử lý mẫu động vật nhuyễn thể sống cố định tại tầng đáy (ốc, sò, ngao), các sinh vật di động tại các tầng nƣớc (cá), đánh giá các quy trình xử lý mẫu để xây dựng quy trình xử lý mẫu tốt nhất đối với từng loại mẫu. - Phân tắch xác định hàm lƣợng các kim loại nặng trong mẫu cá (nhuyễn thể, ốc) trên cơ sở tối ƣu hóa các điều kiện đo và đánh giá phƣơng pháp phân tắch.
- Kết quả phân tắch mẫu thực tế thuộc vùng biển đƣợc đánh giá nguồn gốc và mối tƣơng quan về mức độ tắch tụ kim loại nặng trong động, thực vật thủy sinh tại khu vực này bằng phƣơng pháp phân tắch thống kê đa biến.
2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu đƣợc lựa chọn trong luận văn là 4 loài cá đặc trƣng cho các tầng nƣớc khác nhau của vùng biển Đông Bắc Bắc Bộ với mục đắch nghiên cứu khả năng tắch tụ các kim loại nặng trong thịt cá. Để đối chứng với các mẫu cá trong luận văn có sử dụng thêm 2 mẫu nhuyễn thể hai mảnh và ốc so sánh với khả năng tắch lũy kim loại trong cá.
Cá đuối: là loài cá da trơn sống tại đáy biển, nhiều loài trong vùng nƣớc ven bờ, phần lớn các loài cá đuối có sự phân bố rộng khắp thế giới. Cá đuối ăn các sinh vật tầng đáy nhƣ ốc, trai, hàu, động vật giáp xác, và một vài loài cá, động vật phù du.
Cá nhám: Cá nhám chủ yếu sinh sống ở vùng đáy biển khơi sâu, chúng cũng thƣờng xuyên hiện diện ở những vùng nƣớc nông hơn tại thềm lục địa.Thức ăn chủ yếu của cá nhám đuôi dài là các đàn cá, loài giáp xác và chim biển đi lẻ cũng có thể trở thành nạn nhân của cá nhám
Các loài cá thu, cá ngừ nói chung là các loài cá ăn thịt của đại dƣơng, Điển hình cho họ này là chi cá bạc má phân bố ở vùng biển nhiệt đới, trong đó có vùng biển Việt Nam. Ở Việt Nam, cá phân bố dọc theo vùng ven bờ biển, ở độ sâu từ 12 Ờ 40 m, nhƣng chủ yếu tập trung ở độ sâu 25 Ờ 40 m.
Hình 2.3: cá thu Hình 2.4: Cá mực
Cá mực là một bộ động vật nhuyễn thể thuộc lớp Cephalopoda. Mực nang ăn động vật thân mềm nhỏ, cua, tôm, cá, bạch tuộc, giun và mực nang khác. Cá mực tập trung nhiều nhất ở vùng nƣớc sâu khoảng 30-50m ngoài đại dƣơng, trong khoảng 10-15m ở khu vực Vịnh Bắc bộ.
Nghêu: Nghêu hay ngao là tên gọi dùng để chỉ các loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ (nhuyễn thể) thuộc họ Veneridae chuyên sống ở vùng nƣớc ven biển có độ mặn cao, nhiều đất cát sỏi, phân bố khá phổ biến ở vùng biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới. Nghêu là động vật ăn lọc, không có khả năng chủ động săn mồi và chọn lọc thức ăn, 90% thức ăn là mùn bã hữu cơ, còn lại là sinh vật phù du-chủ yếu là tảo silic, tảo giáp, tảo lam, tảo lục và tảo kim.
Ốc: sống tự nhiên ở những khu rừng ngập mặn hay các bải bồi ven biển, thức ăn là mùn bã hữu cơ, còn lại là sinh vật phù du-chủ yếu là tảo silic, tảo giáp, tảo lam,
- Nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp khối phổ cao tần cảm ứng Plasma để phân tắch hàm lƣợng các nguyên tố kim loại nặng trong động vật cá, nhuyễn thể hai mảnh. Đồng thời trong luận văn có sử dụng các phƣơng pháp phân tắch thống kê, so sánh hỗ trợ cho quá trình đánh giá kết quả.
2.2. Hóa chất và dụng cụ
2.2.1. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 2.2.1.1. Hóa chất 2.2.1.1. Hóa chất
* Dung dịch chuẩn gốc đồng 1000 ổ2 mg/L, loại p.a, Merck, Đức * Dung dịch chuẩn gốc chì 1000 ổ2 mg/L, loại p.a, Merck, Đức * Dung dịch chuẩn gốc cadimi 1000 ổ2 mg/L, loại p.a, Merck, Đức * Dung dịch chuẩn gốc kẽm 1000 ổ2 mg/L, loại p.a, Merck, Đức * Dung dịch chuẩn gốc thori 1000 ổ2 mg/L, loại p.a, Merck, Đức * Dung dịch chuẩn gốc thủy ngân 1000 ổ2 mg/L, loại p.a, Merck, Đức * Dung dịch chuẩn ICP (IV) chứa 23 nguyên tố, loại p.a, Merck, Đức * Nƣớc cất 2 lần, nƣớc deion
* Các dung dịch axắt HNO3 65%, dung dịch H2O2 30%, loại p.a, Merck, Đức
2.2.1.2. Dụng cụ
* Các bình chứa mẫu P.P 250 mL, các ống nghiệm nhựa có nắp đậy P.P 15 mL, 50 mL (Greiner), giá để ống nghiệm.
* Bình định mức nhựa P.P 10mL, 20 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL. * Lọ nhựa P.P đựng dung dịch chuẩn
* Pipet 10ml.
* Micropipet 100, 200, 1000, 5000 ộL, Eppendorf.
2.2.1.3. Thiết bị
* Lò vi sóng Dimension 4, National, Model NN- C988W (năng lƣợng tối đa 900W) kèm theo bộ ống teflon MRP 600/10M (Milestone), Panasonic.
* Máy đo ICP-MS (ELAN 9000) và các thiết bị phụ .
Hệ thống phân tắch ICP-MS điển hình có dạng nhƣ hình 2.5. Hình 2.6 là hình ảnh thiết bị phân tắch ICP-MS đƣợc sử dụng để phân tắch mẫu tại khoa Hoá- Trƣờng
Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội. 11 9 8 7 6 5 4 Ar 1 2 14 3 10 12 13
Hình 2.5: Sơ đồ khối về nguyên tắc cấu tạo của hệ ICP- MS 1. Hệ bơm dẫn mẫu vào buồng tạo sol khắ.
2. Bộ tạo sol khắ mẫu. 3. Đèn nguyên tử hóa mẫu. 4. Bộ khử đầu ngọn lửa ICP. 5. Hệ thấu kắnh ion.
6. Hệ phân giải phổ khối. 7. Trƣờng tứ cực và bộ lọc ion. 8. Detector.
9. Hệ điện tử.
10. Bơm chân không.
11. Bơm chân không loại tubor phân tử. 12. Hệ buồng chân không của máy. 13. Bộ phận cấp khắ Ar.
Hình 2.6: Ảnh máy ICP Ờ MS (ELAN 9000)
2.3. Lấy mẫu, xử lý mẫu, bảo quản mẫu 2.3.1. Lấy mẫu 2.3.1. Lấy mẫu
Mẫu cá đƣợc lấy đại diện ở 3 tầng nƣớc với độ sâu khác nhau.
Tầng đáy: khoảng > 35m từ mặt nƣớc (cá đuối, mẫu nhuyễn thể) Tầng giữa: khoảng 20 - 35 m từ mặt nƣớc (cá nhám, cá thu) Tầng mặt: 0 - 20 cm từ mặt nƣớc (cá mực)
Vị trắ lấy mẫu: Các mẫu đƣợc đặt hàng trực tiếp qua các ngƣ dân đánh bắt ven biển khu vực tỉnh Quảng Ninh, Hải phòng. Vị trắ lấy mẫu đƣợc cung cấp bởi ngƣ dân khi đánh bắt tại vùng biển này.
Bảng 2.1: Vị trắ lấy mẫu nhuyễn thể và ký hiệu mẫu
Vị trắ lấy mẫu Ngày / giờ lấy mẫu Ký hiệu mẫu
Đồ Sơn (Hải Phòng)
Mẫu được lấy tại biển Đồ Sơn. 107ồ46′- 109ồ07′Đông, 20ồ42′49 - 16ồ47′22 Đông
9h ngày 11/08/2013 Ốc 1 Ngao 1 18h ngày 11/08/2013 Sò 1
Cát bà (Hải Phòng)
Mẫu được lấy tại khu vực xã Việt Hải
108ồ52′- 109ồ07′Đông, 20ồ42′- 20ồ54′độ vĩ Bắc
11h ngày 12/08/2013 Ốc 2 Ngao 2 Sò 2
Vân Đồn (Quảng Ninh)
Bãi biển Sơn Hào, xã Quan Lạn
Tọa độ: 21ồ44′19″ - 20ồ24′31″B, 107ồ05′22″ - 108ồ25′28″Đ 10h35Ỗ ngày 13/08/2013 Ốc 3 Ngao 3 Sò 3
Móng Cái ( Quảng Ninh)
Xã Hải Tiến 21o17Ỗ Ờ 20ồ24′31″ Bắc 107o42Ỗ Ờ 109 o42Ỗ07ỖỖĐông 10h35Ỗngày 14/08/2013 Ốc 4 Ngao 4 Sò 4 Cẩm phả (Quảng Ninh)
Phường Cửa Ông, Tọa độ: 21ồ03′42″- 20ồ54′14ỖỖB, 107ồ17′22″-109ồ07Ỗ 12ỖỖĐ 11h 25Ỗngày 15/08/2013 Ốc 5 Ngao 5 Sò 5
Bảng 2.2: Vị trắ lấy mẫu cá và ký hiệu mẫu
Vị trắ lấy mẫu Ngày / giờ lấy mẫu Ký hiệu mẫu
Mẫu được lấy tại biển Đồ Sơn.
107ồ46′- 109ồ07′Đông, 20ồ42′49 - 16ồ47′22 Đông 9h ngày 11/08/2013 Cá Thu 1 Cá Ngừ 1 18h ngày 11/08/2013 Cá đuối 1 Cá Mực 1 Cá nhám 1 Cát bà (Hải Phòng)
Mẫu được lấy tại khu vực xã Việt Hải
108ồ52′- 109ồ07′Đông, 20ồ42′- 20ồ54′độ vĩ Bắc 11h ngày 12/08/2013 Cá Thu 2 Cá Ngừ 2 Cá đuối 2 Cá Mực 2 Cá nhám 2
Vân Đồn (Quảng Ninh)
Bãi biển Sơn Hào, xã Quan Lạn
Tọa độ: 21ồ44′19″ - 20ồ24′31″B, 107ồ05′22″ - 108ồ25′28″Đông 10h35Ỗ ngày 13/08/2013 Cá Thu 3 Cá Ngừ 3 Cá đuối 3 Cá Mực 3 Cá nhám 3
Móng Cái ( Quảng Ninh)
Xã Hải Tiến 21o17Ỗ Ờ 20ồ24′31″ Bắc 107o42Ỗ Ờ 109 o42Ỗ07ỖỖĐông 10h35Ỗ ngày 14/08/2013 Cá Thu 4 Cá Ngừ 4 Cá đuối 4 Cá Mực 4 Cá nhám 4 Cẩm phả (Quảng Ninh)
Phường Cửa Ông, Tọa độ: 21ồ03′42″ - 20ồ54′14ỖỖB , 107ồ17′22″ - 109ồ07Ỗ 12ỖỖĐông 11h 25Ỗngày 15/08/2013 Cá Thu 5 Cá Ngừ 5 Cá đuối 5 Cá Mực 5 Cá nhám 5
Hình 2.7: Bản đồ khu vực lấy mẫu
2.3.2. Xử lý mẫu sơ bộ và bảo quản mẫu
* Mẫu động vật nhuyễn thể:
Ốc, Ngao, sò sống tại các khu vực lấy mẫu trên, sau khi lấy đƣợc rửa sạch lớp vỏ bên ngoài bằng nƣớc biển tại chắnh nơi lấy mẫu để loại bỏ các chất bẩn khác bám trên vỏ của chúng. Sau đó chuyển ốc, ngao, sò vào hộp đựng chứa đầy nƣớc tại khu vực lấy mẫu và chuyển về phòng thắ nghiệm, giữ sống trong nƣớc để chúng nhả gần hết các chất bẩn. Trƣớc khi mổ ốc lấy thịt bên trong cần phải rửa kỹ lớp vỏ bên