3. đỊA đIỂM, THỜI GIAN, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thắ nghiệm
3.3.1.1. Phương pháp nghiên cứu ựặc ựiểm hình thái bọ nhảy sọc cong vỏ lạc P. striolata
Các ựặc ựiểm hình thái của bọ nhảy sọc cong vỏ lạc ựược nghiên cứu và mô tả ở tất cả các pha bao gồm: pha trứng, sâu non, nhộng và trưởng thành. Chụp ảnh bằng kắnh lúp soi nổi Olympus SZX7 với ựộ phóng ựại 10 x 5,6 theo phương pháp mô tả thông thường trong nghiên cứu hình thái côn trùng bao gồm mô tả màu sắc, hình thái cơ thể, ngực, các chân và bụng. Các
chỉ tiêu theo dõi bao gồm: ựo chiều dài, rộng của từng pha. Cùng với việc thu cá thể bố mẹ bọ nhảy sọc cong vỏ lạc trưởng thành trên các ruộng rau cải ngọt ở ngoài cánh ựồng ựể nuôi nghiên cứu sinh học thì chúng tôi cũng thu bắt trưởng thành cho ựẻ và nuôi bắt ựầu từ trứng - sâu non - nhộng ựến trưởng thành ựể phục vụ cho việc nghiên cứu hình thái. (chiều rộng ựược ựo ở phần phình to nhất của cơ thể, chiều dài ựược ựo từ ựỉnh ựầu tới cuối cơ thể). Tiến hành ựo sâu non tuổi 1 ở ngày thứ nhất sau khi nở từ trứng, ựo kắch thước của các tuổi sâu non, nhộng và trưởng thành ở ngày ựầu tiên sau khi lột xác chuyển tuổi (sâu non), lột xác hóa nhộng và vũ hóa thành trưởng thành. Số cá thể nghiên cứu là từ 20 cá thể (và nuôi dự trữ 10 cá thể)..
3.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu ựặc ựiểm sinh học của bọ nhảy sọc cong vỏ lạc P. striolata (Chen và ctv., 1990)
+ Chuẩn bị cây thức ăn nuôi bọ nhảysọc cong vỏ lạc P. striolata:
Thức ăn nuôi trưởng thành bọ nhảy ựể xác ựịnh thời gian phát triển và xác ựịnh sức sinh sản là cây rau cải canh ựược trồng bằng dung dịch thủy canh với thành phần dung dịch sông Gianh với nộng ựộ 0,08% (8 mml ựược pha trong 10 lắt nước) thấm trong 2 loại giá thể khác nhau bao gồm giá thể ựất trộn trấu và giá thể bông thấm nước kết hợp với bìa (ựược ựặt trong các hộp nuôi ựể trong lồng lưới), mỗi hộp nuôi ựược trồng 1 cây cải canh sau 1 tuần thì sẽ ựưa vào sử dụng ựể nuôi bọ nhảy sọc cong vỏ lạc trưởng thành. Thức ăn nuôi sâu non bọ nhảy là rễ cải canh sạch (ựược cắt từ cây trồng theo phương pháp thủy canh)
+ Phương pháp thu trứng bọ nhảy sọc cong vỏ lạc P. striolata:
Bọ nhảy trưởng thành ựược thu từ ngoài tự nhiên, cho ghép ựôi (con ựực có ựốt râu thứ 2 phình to và ựốt 2-4 màu vàng nhạt hơn các ựốt khác, con cái các ựốt râu bình thường), thả 3 cặp trưởng thành vào trong 1 hộp nuôi mỗi hộp trồng 2 cây cải canh 7 ngày tuổi (ựể cho trưởng thành ăn) trên bề mặt hộp
có phủ lớp giấy thấm nước và ựặt 4 rễ cải sạch ựể trưởng thành ựẻ trứng, hộp ựược phủ bên ngoài bằng vải ựen. Sau 6 giờ tiếp xúc thì lấy rễ ra khỏi hộp và dùng kắnh lúp soi rễ ựể tìm trứng (qua quan sát thấy trứng thường ựược ựẻ rời từng quả trên rễ chắnh của cây rau cải hoặc ở phần cổ rễ).
+ Nuôi sinh học bọ nhảy sọc cong vỏ lạc P. striolata:
Lấy 50-70 ựoạn rễ có trứng bọ nhảy thu ựược theo phương pháp ựã ghi ở trên, loại bỏ bớt trứng và chỉ ựể lại mỗi rễ một quả, ựặt trong hộp petri (ử= 10 cm, H= 1,5 cm), ựáy hộp có giấy thấm nước, hộp ựược ựánh số cả nắp và ựáy. Hàng ngày theo dõi vào 7-8 giờ sáng, ựể bổ xung ựộ ẩm. Số lượng trứng tham gia trong thắ nghiệm là từ 50- 66 quả, hàng ngày theo dõi số lượng trứng nở, số lượng trứng không nở, ghi ngày trứng nở vào bảng nuôi sinh học. Bổ sung nước, làm vệ sinh lọ nuôi, thay bông giữ ẩm. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ trứng nở (%) và thời gian phát dục của trứng (ngày).
Sau khi trứng nở, cắt ựoạn rễ cây có sâu non mới nở chuyển sang hộp nuôi mới có rễ cây ựặt trên giấy thấm nước. Theo dõi từ 40 sâu non cho 1 lần thắ nghiệm, trong ựó có 30 sâu non theo dõi chắnh thức và 10 sâu non nuôi dự trữ nếu thấy hiện tượng sâu non bị chết do va chạm khi thay thức ăn thì thay thế. Hai ngày bổ xung rễ mới 1 lần, hàng ngày bổ sung nước. Ngoài hộp nuôi ựược bọc bằng nilon ựen ựể giữ cho sâu non sống giống như trong ựất. Khi thấy sâu non ngừng ăn, nằm im ựể chuyển nhộng thì tách nhộng của bọ nhảy chuyển sang hộp nuôi mới có ựất tiệt trùng, ẩm ựể theo dõi tỷ lệ vũ hóa của nhộng và tỷ lệ ựực cái của trưởng thành.
Cá thể trưởng thành của bọ nhảy sọc cong vỏ lạc vũ hóa từ nhộng của thắ nghiệm trên ựược tiến hành ghép ựôi (1 ựực và 1 cái). Số lượng nuôi cặp bố mẹ cho mỗi lần thắ nghiệm là 30 cặp (ựực:cái) và 10 cặp dự trữ cho 1 lần thắ nghiệm. Nuôi trong hộp nuôi lớn (ử= 20 cm, H= 25 cm) mỗi hộp trồng 1 cây cải canh 7 ngày tuổi (ựể cho trưởng thành ăn), mỗi hộp thả 1 cặp trưởng
thành ựực cái (hộp nuôi ựược tiếp tục giữ số thứ tự của cá thể cái), hộp ựược ựặt thêm 2 rễ cải sach ựể trưởng thành ựẻ trứng, phắa ngoài hộp ựược phủ bằng nilon ựen. Hàng ngày vào một giờ nhất ựịnh thì lấy rễ ra khỏi hộp và thay rễ cải mới vào cho tới khi bọ nhảy chết sinh lý, dùng kắnh lúp soi rễ ựể tìm trứng ựếm số trứng ựược ựẻ ra và ựược nuôi riêng cho tới khi hóa trưởng thành ựể xác ựịnh tỷ lệ giới tắnh. Theo dõi thời gian phát dục trưởng thành trong tủ ựịnh ôn Sanyo ở nhiệt ựộ 250C và 30oC, ẩm ựộ 85%.
Từ kết quả nuôi bọ nhảy trong tủ ựịnh ôn Sanyo ở 2 ngưỡng nhiệt ựộ ổn ựịnh, thức ăn dư thừa chúng tôi xác ựịnh nhịp ựiệu ựẻ trứng của trưởng thành cái, tiến hành theo dõi cá thể cái ựẻ trứng cho ựến khi ngừng ựẻ và chết sinh lý, hàng ngày ựếm số lượng ựẻ trứng. Thắ nghiệm theo dõi với số lượng 10 cá thể cái/ 1 lần thắ nghiệm. Các chỉ tiêu theo dõi là số lượng trứng ựẻ của từng ngày (quả/ngày/trưởng thành cái).
+ Phương pháp xác ựịnh thời gian phát dục:
Thời gian phát dục của pha trứng ựược tắnh bằng thời gian trung bình kể từ khi trứng ựược ựẻ ra tới khi trứng nở. Các pha phát dục tiếp theo (sâu non tuổi 1, 2, 3 và nhộng) ựược xác ựịnh theo dấu vết lột xác. Thời gian trưởng thành trước ựẻ trứng ựược tắnh từ khi nhộng lột xác hóa trưởng thành ựến khi trưởng thành ựẻ quả trứng ựầu tiên. Vòng ựời của bọ nhảy ựược tắnh từ khi trứng ựược ựẻ ra ựến khi bọ nhảy ựẻ quả trứng ựầu tiên. đời của bọ nhảy ựược tắnh từ khi trứng ựược ựẻ ra ựến khi quả trứng ựó phát triển thành trưởng thành chết sinh lý. Thời gian phát dục từng tuổi, pha của bọ nhảy ựược tắnh bằng giá trị trung bình từng pha, tuổi của tất cả các cá thể nghiên cứu (n>30) trong từng ựiều kiện nhiệt ựộ và ựộ ẩm của tủ ựịnh ôn.
Tỷ lệ giới tắnh sẽ ựược tắnh dựa trên số cá thể nuôi phát triển ựến lúc trưởng thành (ựể có thể phân biệt dựa vào râu ựầu và một vài ựặc ựiểm cơ bản)
+ Tắnh chỉ số gia tăng tự nhiên theo Birch (1948), Pielow (1977)
Khả năng phát triển của các loài nói chung và của bọ nhảy nói riêng ựược ựánh giá thông qua tổng hợp của một loạt các yếu tố bao gồm tốc ựộ phát triển, khả năng sinh sản, tỷ lệ ựực cái, và tỷ lệ sống sót của con cái trong một môi trường nào ựó. Ở ựây là môi trường không hạn chế về không gian, thức ăn dư thừa, không có ảnh hưởng của cá thể khác hoặc kẻ thù tự nhiên. Với môi trường này, khả năng tăng quần thể là cao nhất, ựược ựặc trưng bởi một trị số quan trọng là tỷ lệ tăng tự nhiên. Trị số này còn gọi là chỉ số môi trường
Chỉ số môi trường ựược tắnh theo công thức: DN
--- = r.N DT
DN: Số lượng chủng quần gia tăng trong thời gian dt N: Số lượng chủng quần ban ựầu
DT: Thời gian tăng ựôi quần thể với DT= ln (2)/ rm hay DT= ln Ro/ rm
Hay r= b-d, trong ựó b: Tỷ lệ sinh D: Tỷ lệ chết Hoặc dạng Nt = N0.e- rx=1 (1)
để tắnh ựược (1) phải nuôi sinh học với số cá thể (n>30)
ựể Lập bảng sống (life- table) bao gồm số liệu sinh sản (mx) và tỷ lệ sống (lx) qua các tuổi (x) ựể tắnh ựược (2).
Tỷ lệ sống (lx) là xác suất sống sót của cá thể cái ở tuổi x.
Số liệu sinh sản (mx) là số con cái sống sót trung bình ựược một cá thể mẹ ở tuổi x ựẻ ra trong một ựơn vị thời gian.
Tổng số con cái sinh ra sống sót trong một thế hệ (do một mẹ ựẻ ra) là hệ số nhân của một thế hệ: Ro = ∑ lx.mx (2)
Thời gian của một thế hệ: Tc và T là tuổi trung bình của tất cả các cá thể mẹ khi ựẻ con cái Tc = ∑x. lx.mx/Ro (3)
T= x. lx.mx. e- rx (4)
Tc ựược tắnh theo cơ sở mẹ còn T ựược tắnh theo con mới sinh Và chỉ số giới hạn tăng tự nhiên λ =antilog e r (5) Tắnh r, λ, R0, Tc, T, DT thông qua phần mềm Microsoft Excel Tổng số con ựực Tỷ lệ ựực/cái= --- Tổng số con cái Tổng số con cái Tỷ lệ cái (%) = --- x100 Tổng số cá thể theo dõi Số sâu ở ngày thứ i Hệ số nhân (k) =--- Số sâu ban ựầu
3.3.1.3. Phương pháp xác ựịnh hiệu lực của thuốc BVTV phòng trừ bọ nhảy sọc cong vỏ lạc P. striolata trong phòng thắ nghiệm
Sử dụng 5 loại thuốc trừ sâu thế hệ mới ựược khuyến cáo có khả năng phòng trừ loài bọ nhảy sọc cong tốt .
để nghiên cứu hiệu lực của một số loại thuốc trên phòng trừ loài bọ nhảy sọc cong, chúng tôi tiến hành trồng cây rau cải trong các khay có nắp ựậy (ựảm bảo ựộ thoáng và bọ nhảy không thể chui qua ựược từ nắp có khoét lỗ và dán lưới), nguồn bọ nhảy thử nghiệm ựược nuôi trong phòng thắ nghiệm, xử lý các cá thể trưởng thành ựể thử thuốc. Số lượng cá thể bọ nhảy cho các thắ nghiệm là 20 con/1 công thức với 3 lần lặp lại. Bố trắ 6 công thức như sau:
Công thức Tên thuốc Nồng ựộ
(%) Tên hoạt chất Nhóm ựộc
I Emaben 2.0 EC 0,10 Emamectin
Benzoat
3
II Sokotin 0.3EC 0,08 Matrine 3
III Trusach 2.5EC 0,08 Rotenone 3
IV Mopride 20WP 0,15 Acetamiprid 4
V Otoxes 200SP 0,15 Acetamiprid 2
VI đối chứng ựược phun nước lã
-
Cho các loại thuốc ựã pha vào bình tiến hành phun sương lên các cây rau thắ nghiệm có bọ nhảy trưởng thành ựang ăn lá. Thời gian phun và số lượng thuốc ựược phun lên cây rau thắ nghiệm ở các công thức là giống nhau. Theo dõi thắ nghiệm trong thời gian 12 giờ, 24 giờ và 48 giờ sau khi phun thuốc, ghi chép lại các cá thể sống. đối với các cá thể say thuốc hay chưa chết chúng tôi cũng ghi chép lại và tiến hành theo dõi cho những ngày tiếp theo. Các kết quả tắnh hiệu lực phòng trừ của thuốc trừ sâu ựối với bọ nhảy hay ở các công thức thắ nghiệm ựược tắnh theo công thức Abbott:
Ca- Ta
E(%) = x 100 Ca
Ta: Số lương sâu non sống ở công thức sử lý thuốc
3.3.1.4. Phương pháp xác ựịnh hiệu lực của thuốc BVTV phòng trừ bọ nhảy sọc cong vỏ lạc P. striolata trên ựồng ruộng
a. Phương pháp xác ựịnh hiệu lực của một số loại thuốc BVTV phòng trừ bọ nhảy sọc cong vỏ lạc P. striolata ở ngoài ựồng ruộng
Trên cánh ựồng trồng rau cải thuộc xã Văn đức-huyên Gia Lâm tiến hành xác ựịnh hiệu lực của 5 loại thuốc trừ sâu. Các thử nghiệm ựược lặp lại 3 lần. Thuốc ựược phun bằng bình phun thuốc ựeo vai 10 lắt. Xác ựịnh hiệu lực trừ bọ nhảy sau khi phun 3, 5 và 7 ngày. Mỗi ô thắ nghiệm có diện tắch là 30m2. Tiến hành ựiều tra mật ựộ bọ nhảy trưởng thành theo 5 ựiểm chéo góc (mỗi ựiểm có diện tắch 1 m2). Thắ nghiệm ựược quây nilon ựen cao 1,5m. Tắnh toán hiệu lực của thuốc bằng công thức Henderson-Tilton. Các công thức ựều ựược so sánh với công thức ựối chứng phun bằng nước lã.
Các công thức thắ nghiệm:
CT1: Sử dụng thuốc Emaben 2.0EC CT2: Sử dụng thuốc Sokotin 0.3 EC CT3: Sử dụng thuốc Trusach 2.5EC CT4: Sử dụng thuốc Mopride 20WP CT5: Sử dụng thuốc Otoxes 200SP CT6: đối chứng (Phun nước lã)
Chỉ tiêu theo dõi: mật ựộ bọ nhảy trưởng thành (con/m2) vào các thời ựiểm trước khi phun và sau khi phun: 3, 5, 7 ngày.
Ta x Cb
(1 - ) x 100 Tb x Ca
Hiệu lực thuốc trừ sâu ngoài ựồng ruộng tắnh theo công thức Henderson - Tilton:
HL: Hiệu lực thuốc
Ta : Số cá thể sống ở công thức thắ nghiệm sau khi xử lý thuốc.
Tb : Số cá thể sống ở công thức thắ nghiệm trước khi phun thuốc. Ca : Số cá thể sống ở công thức ựối chứng sau khi phun thuốc. Cb : Số cá thể sống ở công thức ựối chứng trước khi phun thuốc.
b. Phương pháp xác ựịnh hiệu lực phòng trừ sâu non bọ nhảy sọc cong vỏ lạc P. striolatatrong các tầng ựất của một số loại thuốc
Tiến hành nghiên cứu số lượng sâu non bọ nhảy sọc cong vỏ lạc P.
striolata trong ựất bằng phương pháp ựiều tra nhóm côn trùng ựất thông
thường bao gồm: đào phẫu diện hố 20 x 20cm, theo ựộ sâu ứng với các tầng phân bố: 0-5cm (tầng 1), 5.1-10 cm (tầng 2) và 10.1-15cm (tầng 3) . Tại mỗi tầng sử dụng panh, kẹp và ống hút ựể thu bắt tất cả các mẫu sâu non bọ nhảy sọc cong vỏ lạc có mặt ở các tầng ựất nghiên cứu. Ở các công thức thắ nghiệm phun thuốc, tiến hành ựiều tra trước phun 1 ngày, sau 7 ngày phun với mỗi công thức. Các loại thuốc ựược thử nghiệm là Mopride 20WP, Sokotin 0.3EC và Otoxes 200SP. Sử dụng phương pháp ựào phẫu diện với 3 tầng ựất như trên với số lượng là 5 hố ựào/1 công thức thử thuốc với 3 lần lặp lại. đếm tất cả số lượng sâu non bọ nhảy sọc cong còn sống ở mẫu ứng với các tầng ựất nghiên cứu. Tắnh toán hiệu lực phòng trừ sâu non bọ nhảy sọc cong vỏ lạc bằng công thức Henderson-Tilton. Thuốc ựược phun bằng bình ựeo vai 10 lắt.