3. Nội dung nghiên cƣ́u
2.2.1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA tổng số
Chúng tôi tiến hành định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết được bằng 2 phương pháp.
Phương pháp quang phổ hấp thụ
Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (A260) của các mẫu cho phép xác định hàm lượng acid nucleic trong mẫu dựa vào mối tương quan: một đơn vị A260 tương ứng với nồng độ 50 ng/µl cho dung dịch chứa DNA sợi đôi.
Hàm lượng DNA (ng/µl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng
Để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu DNA tách chiết được, chúng tôi tiến hành đo thêm giá trị mật độ quang ở bước sóng 280 nm (A280). Độ tinh sạch được thể hiện ở tỷ số A260/A280. Một dung dịch DNA được coi là sạch khi tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0.
Phương pháp điện di DNA tổng số trên gel agarose
Điện di kiểm tra DNA tổng số của mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8% (0,8 g agarose trong 100 ml dung dịch TAE 1X). Sản phẩm điện di được nhuộm bằng dung dịch ethydium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Dựa vào hình ảnh điện di có thể đánh giá nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.2.1.3. Phƣơng pháp RAPD
Phản ứng RAPD được tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phương pháp của Foolad và đtg (1995) [30]. Sử dụng 16 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp bởi hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự của các mồi được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2: Trình tự nucleotide của 16 mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi
M1 5’AACCGACGGG 3’ M10 5’CTATGCCAGC3’ M2 5’GGGGGTCGTT 3’ M11 5’CGGCCCACGT3’ M3 5’TACCACCCCG 3’ M14 5’TAGGCGAACG3’ M4 5’GGCGGACTGT 3’ M15 5’CACGGCTGCG3’ M5 5’TCGGCGATAG 3’ M16 5’GTATGGGGCT3’ M7 5’CAGCACCCAC3’ M17 5’GCGAACCTCG3’ M8 5’GGAAGTCGCC3’ MTR1 5’CGGCATAGCG3’ M9 5’CCTGCAGTGT3’ MTR4 5’CACCGTAGCG3’
Phản ứng RAPD được thực hiện trong 25µl dung dịch và sản phẩm RAPD được điện di trên gel agarose 1,8%, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh. Thành phần của phản ứng RAPD được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RAPD STT Thành phần Thể tích (µl) 1 PCR master mix 12.5 2 Mồi (10µM) 1.2 3 Nước 7.3 4 DNA mẫu (50ng) 4 Tổng 25
Phản ứng RAPD thực hiện trong máy AB – applied – biosystems theo chu kỳ nhiệt được trình bày ở bảng 2.4 như sau:
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD