3. Nội dung nghiên cƣ́u
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.1.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số
Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số theo Gawel và Jarret (1991) [31] như sau:
(1) Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
(2) Bổ sung 800 μl đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi (làm 2 lần )
(3)Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
(4) Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. (5) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
(6) Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
(7) Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng.
(8) Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. (9) Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ.
(10) Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn. (Làm 2 lần) (11) Làm khô DNA bằng máy speed vac.
2.2.1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA tổng số
Chúng tôi tiến hành định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết được bằng 2 phương pháp.
Phương pháp quang phổ hấp thụ
Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (A260) của các mẫu cho phép xác định hàm lượng acid nucleic trong mẫu dựa vào mối tương quan: một đơn vị A260 tương ứng với nồng độ 50 ng/µl cho dung dịch chứa DNA sợi đôi.
Hàm lượng DNA (ng/µl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng
Để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu DNA tách chiết được, chúng tôi tiến hành đo thêm giá trị mật độ quang ở bước sóng 280 nm (A280). Độ tinh sạch được thể hiện ở tỷ số A260/A280. Một dung dịch DNA được coi là sạch khi tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0.
Phương pháp điện di DNA tổng số trên gel agarose
Điện di kiểm tra DNA tổng số của mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8% (0,8 g agarose trong 100 ml dung dịch TAE 1X). Sản phẩm điện di được nhuộm bằng dung dịch ethydium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Dựa vào hình ảnh điện di có thể đánh giá nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.2.1.3. Phƣơng pháp RAPD
Phản ứng RAPD được tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phương pháp của Foolad và đtg (1995) [30]. Sử dụng 16 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp bởi hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự của các mồi được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2: Trình tự nucleotide của 16 mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi
M1 5’AACCGACGGG 3’ M10 5’CTATGCCAGC3’ M2 5’GGGGGTCGTT 3’ M11 5’CGGCCCACGT3’ M3 5’TACCACCCCG 3’ M14 5’TAGGCGAACG3’ M4 5’GGCGGACTGT 3’ M15 5’CACGGCTGCG3’ M5 5’TCGGCGATAG 3’ M16 5’GTATGGGGCT3’ M7 5’CAGCACCCAC3’ M17 5’GCGAACCTCG3’ M8 5’GGAAGTCGCC3’ MTR1 5’CGGCATAGCG3’ M9 5’CCTGCAGTGT3’ MTR4 5’CACCGTAGCG3’
Phản ứng RAPD được thực hiện trong 25µl dung dịch và sản phẩm RAPD được điện di trên gel agarose 1,8%, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh. Thành phần của phản ứng RAPD được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RAPD STT Thành phần Thể tích (µl) 1 PCR master mix 12.5 2 Mồi (10µM) 1.2 3 Nước 7.3 4 DNA mẫu (50ng) 4 Tổng 25
Phản ứng RAPD thực hiện trong máy AB – applied – biosystems theo chu kỳ nhiệt được trình bày ở bảng 2.4 như sau:
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD
2.2.1.4. Phân tích số liệu RAPD
Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, sự xuất hiện các băng điện di được ước lượng kích thước và thống kê các băng điện di với từng mồi ở từng mẫu nghiên cứu. Sự xuất hiện hay không xuất hiện các băng điện di được tập hợp để phân tích số liệu theo nguyên tắc: Số 1- xuất hiện phân đoạn DNA và số 0 - không xuất hiện phân đoạn DNA. Các số liệu này được xử lý trên máy tính theo phần mềm NTSYS pc version 2.0 (USA, 1998) để xác định quan hệ di truyền của các giống đậu tương.
Xác định hệ số đa dạng di truyền (Genetic Diversity Index) trong cấu trúc DNA dựa trên các phân đoạn DNA được nhân bản (HRAPD) theo công
thức: n i i RAPD f H 1 2 1
HRAPDlà hệ số đa dạng di truyền
fi là tần suất của alen thứ i
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 4 phút 1
2 Biến tính 92 45 giây
45
3 Gắn mồi 36 45 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ KHỐI LƢỢNG 1000 HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU
Hình thái và khối lượng hạt là một trong những đặc tính quan trọng được quan tâm trong công tác chọn tạo giống đậu tương.
Khối lượng 1000 hạt là một trong các yếu tố quan trọng cấu thành năng suất của cây đậu tương, tính trạng này do kiểu gen chi phối và có thể thay đổi do chế độ chăm sóc, mùa vụ và điều kiện môi trường. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1.
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương biểu hiện khác nhau và phụ thuộc vào kích thước và độ đồng đều của hạt. Khối lượng hạt của 30 giống đậu tương dao động từ 74,6 g đến 194,61g. Trong các giống đậu tương nghiên cứu thì giống VNlc8 khối lượng hạt cao nhất 194,61g, thấp nhất là giống VNlc28 có khối lượng 74,6g. Có thể xếp theo thứ tự từ cao đến thấp về khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương như sau: VNlc8 > VNlc3 > VNlc2 > VNlc25 > VNlc7 > VNlc4 > VNlc23 >VNl24 > VNlc1 > VNlc10 > VNlc13> VNlc22 > VNlc20 > VNlc5 > VNlc18> VNlc11 > VNlc16 > VNlc9 > VNlc29 >VNlc14> VNlc15>VNlc12 > VNlc6 > VNlc27 > VNlc30 > VNlc21 > VNlc17 >VNlc26 > VNlc19 >VNlc28 .
Màu vỏ hạt của các giống đậu tương nghiên cứu bao gồm: Vàng, vàng trắng, vàng đậm, vàng xanh, vàng loang, vàng phớt xanh, vàng nhạt, xanh vàng, xanh nhạt, nâu, đen. Đặc biệt là đậu tương hạt đen, có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột.
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của 30 giống đậu tương
TT Tên giống Màu sắc hạt Hình dạng hạt Màu rốn hạt Khối lƣợng 1000 hạt (g) 1 VNlc1 Vàng trắng Ô van Đen 148,90 2 VNlc2 Vàng trắng Trứng Đen 185,40 3 VNlc3 Vàng đậm Ô van Nâu 189,30 4 VNlc4 Vàng Ô van Nâu nhạt 162,80 5 VNlc5 Xanh nhạt Ô van Nâu 112,50 6 VNlc6 Xanh nhạt Ô van Nâu 101,52 7 VNlc7 Vàng Ô van Nâu 162,90 8 VNlc8 Vàng Trứng Nâu 194,61 9 VNlc9 Xanh nhạt Ô van Nâu 103,54 10 VNlc10 Vàng nhạt Ô van Nâu nhạt 148,45 11 VNlc11 Đen Ô van Đen 105,30 12 VNlc12 Xanh vàng Ô van Đen 102,50 13 VNlc13 Vàng Ô van Đen 139,10 14 VNlc14 Nâu đậm Ô van Nâu 103,30 15 VNlc15 Vàng xanh Ô van Nâu đậm 102,60 16 VNlc16 Xanh vàng Ô van Nâu 104,80 17 VNlc17 Vàng Ô van Đen 90,40 18 VNlc18 Xanh vàng Ô van Nâu 108,30 19 VNlc19 Vàng Trụ Nâu đậm 75,00 20 VNlc20 Vàng Ô van Đen 113,60 21 VNlc21 Vàng Trụ Nâu 91,80 22 VNlc22 Vàng Ô van Nâu đậm 115,00 23 VNlc23 Đen Trứng Đen 158,70 24 VNlc24 Vàng Trứng Nâu 153,80 25 VNlc25 Nâu Ô van Nâu đậm 166,80 26 VNlc26 Vàng loang Ô van Nâu đậm 83,30 27 VNlc27 Xanh vàng Ô van Nâu đậm 100,50 28 VNlc28 Vàng phớt xanh Ô van Nâu 74,60 29 VNlc29 Vàng Trụ Nâu đen 103,30 30 VNlc30 Vàng Ô van Đen 93,20
Màu sắc chủ yếu của rốn hạt ở các giống đậu tương nghiên cứu là màu đen, màu nâu, màu nâu đậm, màu nâu đen. Đây là đặc điểm hình thái quan trong sử dụng trong chọn giống để nhận dạng giống đậu tương trồng.
Về hình dạng hạt, các giống đậu tương nghiên cứu có nhiều hình dạng khác nhau, bao gồm hình trụ, ô van và hình trứng.
Kết quả phân tích màu sắc vỏ hạt, màu rốn hạt, hình dạng hạt và khối lượng 1000 hạt đã cho thấy sự đa dạng về hình thái, kích thước hạt của các giống đậu tượng địa phương. Đây chính là cơ sở để đánh giá hiện trạng nguồn gen cây đậu tượng địa phương Việt Nam và cũng là nguồn vật liệu chọn giống phong phú cần đươc khai thác có hiệu quả.
3.2. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG TRONG HỆ GEN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG BẰNG KỸ THUẬT RAPD ĐẬU TƢƠNG BẰNG KỸ THUẬT RAPD
Công nghệ sinh học đang có nhiều đóng góp có giá trị sản xuất nông nghiệp, đặc biệt trong lĩnh vực chọn giống cây trồng. Kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng nhằm đánh giá sự đa dạng trong hệ gen và xác định mối quan hệ di truyền của thực vật, trong đó RAPD là một kỹ thuật khá thuận lợi và có hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả ứng dụng RAPD vào việc phân tích tính đa hình DNA của 30 giống đậu tương.
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá đậu tƣơng
Lá non đậu tương 14 ngày tuổi được sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Kiểm tra chất lượng tách chiết DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.1) và xác định hàm lượng DNA trên máy quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Hình 3.1 cho thấy DNA tổng số có một băng duy nhất, rõ nét ở gần giếng truyền mẫu. Kết quả kiểm tra DNA trên máy quang phổ cho thấy dung dịch DNA tách chiết được có hàm lượng và độ tinh
sạch (tỷ số A260/A280 là 1,8 - 2,0) đảm bảo và có thể sử dụng cho các phân tích DNA tiếp theo
Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số của 30 giống đậu tương nghiên cứu
1.VNlc1, 2.VNlc2, 3.VNlc3, 4.VNlc4, 5.VNlc5, 6.VNlc6, 7.VNlc7, 8.VNlc8, 9.VNlc9, 10.VNlc10, 11.VNlc11, 12.VNlc12, 13.VNlc13, 14.Vlnc14, 15.VNlc15, 16.VNlc16, 17.VNlc17, 18.VNlc18, 19.VNlc19, 20.VNlc20, 21.VNlc21, 22.VNlc22, 23.VNlc23, 24.VNlc24, 25.VNlc25, 26.VNlc26, 27.Vnl27, 28.VNlc28,29.VNlc29, 30.VNlc30
3.2.2. Kết quả nhân bản các phân đoạn DNA bằng kĩ thuật RAPD
Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi pha loãng DNA về nồng độ 50ng/μl và tiến hành các phản ứng RAPD với sự sàng lọc 16 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của mồi đó càng cao), khoảng cách di truyền được xác định thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây. Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,8%.
Phân tích RAPD với 16 mồi kết quả thu được số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản với mỗi mồi dao động từ 60 đến 138 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,25 kb đến 2,5 kb. Tổng số phân đoạn DNA nhân bản được của 16 đoạn mồi RAPD khi phân tích 30 giống đậu tương là 1388 phân đoạn. Trong số 16 mồi phân tích, số
phân đoạn DNA được nhân bản của 30 giống đậu tương ở mồi M8 là nhiều nhất (138 phân đoạn DNA) và số phân đoạn được nhân bản ít nhất là ở mồi M11 và MTr2 (60 phân đoạn DNA).
Đối với mỗi giống đậu tương thì số phân đoạn được nhân bản có sự khác nhau, dao động từ 40 phân đoạn đến 52 phân đoạn. Giống có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 16 mồi nhiều nhất là giống VNlc22 (52 phân đoạn), và giống có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 16 mồi ít nhất là giống VNlc16 (40 phân đoạn). Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các giống đậu tương với nhau trong cùng một mồi. Điều này được tổng kết và thể hiện qua tỷ lệ phân đoạn đa hình ở mỗi mồi nghiên cứu, kết quả tổng hợp trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 16 mồi RAPD
Mồi Số phân đoạn DNA
Số phân đoạn đa hình
Số phân đoạn đơn hình
Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%) M1 7 7 0 100 M2 7 6 1 85,7 M3 5 3 2 60,0 M4 7 6 1 85,7 M5 7 7 0 100 M7 8 8 0 100 M8 7 7 0 100 M9 6 4 2 66,7 M10 6 3 3 50,0 M11 2 0 2 0 M14 4 3 1 75,0 M15 6 6 0 100 M16 6 3 3 50,0 M17 5 5 0 100 MTr2 2 0 2 0 MTr4 8 8 0 100 Tổng 93 76 17 81,7
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, tổng số phân đoạn DNA của 30 giống đậu tương khi phân tích 16 mồi ngẫu nhiên là 93 phân đoạn, trong đó có 76 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 81,7%) và không đa hình là 17 phân đoạn (chiếm 18,3%). Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,25 kb đến 2,5 kb. Số lượng các phân đoạn tương ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng 2 đến 8 phân đoạn, trong đó mồi nhân bản được ít phân đoạn DNA nhất là mồi M11 và MTr2 (2 phân đoạn), và mồi nhân được nhiều phân đoạn DNA nhất là mồi M7, MTr4 (8 phân đoạn)
Bảng 3.2 cũng cho thấy, có 14 mồi đều biểu hiện tính đa hình, 2 mồi thể hiện tính đơn hình đó là mồi M11 và MTr2. Tuy nhiên, mức độ đa hình giữa các mồi là khác nhau. Mồi biểu hiện tính đa hình thấp nhất đó là mồi M10 và M16 (50%), mồi biểu hiện tính đa hình cao nhất là các mồi M1, M5, M7, M8, M15, M17, MTr4 (100%). Giá trị PIC (Polymophism Information Content) được sử dụng khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình. Giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỷ lệ phân đoạn DNA đa hình mà còn liên quan trực tiếp với số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ. Tính đa hình của các mồi RAPD còn được đánh giá thông qua giá trị PIC, giá trị PIC càng lớn thì sự đa hình càng cao và ngược lại.
n i i f PIC 1 2
1 Trong đó, fi là tần số của alen thứ i
Từ bảng 3.3 cho thấy, có 9/16 mồi RAPD (M1, MTr4, M7, M5, M17, M4, M2, M15, M8 ) cho kết quả đa hình cao, với giá trị PIC > 0,5. Tuy nhiên, sự đa hình của các mồi không tỷ lệ thuận với số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản. Chẳng hạn, đối với mồi M1 có 7 phân đoạn DNA được nhân bản nhưng lại có giá trị PIC cao nhất (0,88), trong khi đó mồi M8 cũng có 7 phân đoạn DNA được nhân bản nhưng giá trị PIC lai thấp hơn (0,52). Số liệu
bảng 3.3 cho thấy, hầu hết các mồi đều cho tính đa hình cao (PIC > 0,5). Trong 16 mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD có 7 mồi M10, M3, M9, M16, M14, M11, MTr2 là thể hiện tính đa hình thấp (PIC < 0,5). Điều này cho thấy mức độ đa dạng về phân đoạn DNA của các mẫu đậu tương mà chúng tôi nghiên cứu tương đối cao. Như vậy, với 16 mồi ngẫu nhiên đã phản ánh sự đa dạng di truyền của 30 giống đậu tương có nguồn gốc khác nhau.
Bảng 3.3. Thông tin tính đa hình (PIC) của các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD khi nhân bản DNA của 30 giống đậu tương địa phương
STT Tên mồi PIC STT Tên mồi PIC
1 M1 0,88 9 M10 0,49 2 M2 0,67 10 M11 0 3 M3 0,48 11 M14 0,30 4 M4 0,76 12 M15 0,66 5 M5 0,81 13 M16 0,33 6 M7 0,83 14 M17 0,80 7 M8 0,52 15 MTr2 0 8 M9 0,46 16 MTr4 0,87
Kết quả điện di kiểm tra phản ứng RAPD trên gel agarose 1,8% của 16 mồi được chúng tôi phân tích chi tiết thông qua các ảnh điện di được trình bày dưới đây:
Mồi M1
Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M1 của 30 giống đậu tương
Ký hiệu: M: Marker 1kb
1.VNlc1, 2.VNlc2, 3.VNlc3, 4.VNlc4, 5.VNlc5, 6.VNlc6, 7.VNlc7, 8.VNlc8, 9.VNlc9, 10.VNlc10, 11.VNlc11, 12.VNlc12, 13.VNlc13, 14.Vlnc14, 15.VNlc15, 16.VNlc16, 17.VNlc17, 18.VNlc18, 19.VNlc19, 20.VNlc20, 21.VNlc21, 22.VNlc22, 23.VNlc23, 24.VNlc24, 25.VNlc25, 26.VNlc26, 27.VNl27, 28.VNlc28, 29.VNlc29, 30.VNlc30.
Kết quả diện di sản phẩm RAPD của 30 giống đậu tương nghiên cứu với mồi M1 thu được các phân đoạn DNA được nhân bản dao động trong khoảng từ 2 đến 3 phân đoạn. Các phân đoạn xuất hiện ở 7 vị trí khác nhau