3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài
2.3.2. Phương pháp xác ựịnh Virus Dịch tả Vịt bằng phản ứng PCR
Năm 1999, Pritchard L.T. & cs ựã phát hiện phương pháp PCR ựể phục vụ cho việc phân lập virus dịch tả vịt ở Việt Nam. Phương pháp này cho phép phân biệt nhanh và chắnh xác giữa bệnh dịch tả vịt với một số bệnh do Herpesvirrus gia cầm khác gây nên như bệnh Marek, bệnh viêm thanh khắ quản truyền nhiễm và bệnh do Herpesvirus gây ra ở Ngỗng
Phương pháp PCR hay phản ứng chuỗi polymerase là một phương pháp tạo dòng invitro, không cần sự hiện diện của tế bàọ PCR là một phản ứng sinh hóa phụ thuộc nhiệt ựộ dựa theo nguyên tắc sử dụng ựoạn mồi chuyên biệt ựể tổng hợp nên một mạch DNA mới bổ sung với ựoạn DNA khuôn mẫụ Phương pháp PCR dựa trên trên hoạt ựộng của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một ựầu của mạch khuôn. đoạn mồi này sau ựó sẽ ựược nối dài nhờ hoạt ựộng của DNA polymerase ựể hình thành một mạch mới hoàn chỉnh.(Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003); (Võ Thị Thương Lan, 2002).
Một phản ứng PCR gồm có 6 thành phần tham gia: 1) DNA làm khuôn;
2) Hai ựoạn mồi ( bao gồm mồi xuôi và mồi ngược); 3) Enzym DNA Ờ polymerase chịu nhiệt;
4) Môi trường ựệm cung cấp ion Magie (Mg+ +);
5) Phần nucleotide ở dạng deoxynucleotid (ký hiệu dNTP) 6) Nước tinh kiết.
Có 3 giai ựoạn (ba bước ựiều chỉnh nhiệt ựộ) cho 1 chù kỳ:
1. Bung liên kết của DNA; được thực hiện ở nhiệt ựộ 900C Ờ 980C trong vài giây ựến vài phút, các phân tử DNA xoắn kép sẽ bị tách ra, tạo nên các sợi
ựơn dùng ựể làm khuôn cho các ựoạn mồi bám vào enzyme DNA Ờ polymerase xúc tác tổng hợp.
2. Mồi bám (hay còn gọi là ủ với mồi): Nhiệt ựộ ựược hạ xuống 370 Ờ 680C ựể các ựoạn mồi bám vào các trình tự bổ xung tương ứng trên các phân tử DNA làm khuôn.
3. Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài): Nhiệt ựộ ựược nâng lên 680C Ờ 720C trong vài chục giây ựến vài chục phút, ựể các sợi DNA vừa ựược tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên DNA sợi kép, chắnh là sản phảm PCR.
Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25 Ờ 35 Ờ 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối cùng có một chu kỳ bổ xung ựược duy trì ở nhiệt ựộ 720C trong 5 Ờ 10 phút sao cho tất cả các sợi ựơn DNA mới xoắn lại, tạo nên sản phẩm PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNẠ Cuối cùng, nhiệt ựộ hạ xuống 40C ựể bảo quản sản phẩm. Kết quả là từ một ựoạn DNA bất kỳ có thể ựược nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần (2n sau n chu kỳ) mà không cần ựến tế bào sinh vật.
Sản phẩm của PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNA ựược kiểm tra bằng cách chạy ựiện di trên thạch agarose nồng ựộ 0,8 Ờ 2%.
Kỹ thuật ựiện di trên gel là hết sức quan trọng ựối với người làm kỹ thuật di truyền, vì ựó là cách chủ yếu làm cho các ựoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một số ựặc tắnh là các phân tử acid nucleic ở pH trung tắnh chúng tắch ựiện âm nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodiester của các sợi acid nucleic. Khi ựặt chúng vào ựiện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose hay các loại thạch ựặc biệt khác, các phân tử acid nucleic tùy theo kắch thước sẽ chuyển dịch với các tốc ựộ khác nhau: Loại có phân tử lượng lớn chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ chuyển dịch nhanh hơn. Kiểu loại gel dùng trong ựiện di có tác dụng rất quan trọng ựối với mức ựộ phân tách các phân tử acid nucleic, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kắch cỡ của các lỗ có trong gel. Có hai loại gel ựược sử dụng phổ biến là
agarose và polyacrylamid. Agarose ựược chiết xuất từ tảo biển, có thể mua ở dạng bột khô, bị nóng chảy ở nhiệt ựộ trên 450, trong dung dịch ựệm ở nồng ựộ thắch hợp, thường trong khoảng 0,3 Ờ 2,0%(w/v). Khi làm nguội (dưới 450), agarose ựông lại thành gel. Gel agarose thường ựược dùng ựể chạy trong máy ựiện dị Gel polyacrylamid thường ựược dùng ựể tách các phân tử acid nucleic vào gel và ựặt một ựiện áp vào ựó. Trạng thái ựó ựược duy trì cho ựến khi chất nhuộn ựánh dấu (xanh Bromophenol) bổ sung vào mẫu trước khi ựưa vào gel chạy tới ựầu cuối của gel. Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng bằng màu trắng, có thể chụp ảnh ựược và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và ựược quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoạị Kắch thước các băng DNA ựược so sánh với chỉ thị di truyền DNA (DNA marker) ựược cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR (Lê Thanh Hòa, 2002).
Theo Vũ Minh Thục (2004), nhược ựiểm chắnh của phương pháp PCR là sự nhạy cảm khác thường của chúng, làm cho chúng rất dễ có kết quả Ộdương tắnh saiỢ, và thường diễn ra bởi một số lượng nhỏ DNA bị nhiễm chéo trong phòng thắ nghiệm. Tuy nhiên riêng với bệnh dịch tả vịt, Hansen (1999) ựã khẳng ựịnh sự ựặc trưng của ựoạn mồi ựã kiểm tra với bộ gen khuân mẫu của các loại Herpesvirus gây bệnh ở gia cầm khác như đại bàng, chim câu, gàẦkết quả cho thấy sự khuếch ựại vẫn không cho sản phẩm. điều này có nghĩa là phản ứng này ựặc hiệu rất cao cho DNA cho Virus của virus dịch tả vịt
Với hai ựoạn mồi sẽ có khả năng phát hiện 1fg của DNA từ virus dịch tả vịt và phản ứng PCR ựược ựánh giá là nhạy bén hơn gấp 20 lần so với việc chẩn ựoán bệnh dịch tả vịt bằng nuôi cấy tế bàọ
* Tách chiết DNA tổng số của virus
Muốn tách ựược virus, tiến hành tách DNA của tế bào, virus có trong bệnh phẩm gọi là DNA tổng số hay DNA hỗn hợp. DNA tổng số ựược tách ra bao gồm: DNA của hệ gen virus (nếu tế bào nhiễm virus dịch tả vịt (DEV: Duck
enteritis virus)), DNA của nhân tế bào chủ và của hệ gen ty thể, RNA các loại (nếu không dùng enzym phá huỷ RNA) và có thể có lẫn RNA khác.
Về nguyên tắc, khi sử dụng mồi ựặc hiệu cho DEV thì ựoạn gen polymerase của DEV sẽ ựược nhân lên bằng phản ứng PCR, sản phẩm của PCR là ựoạn gen của riêng gen DNA-polymerase của dịch tả vịt.
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) ựể tách chiết DNA tổng số, mô tả tóm tắt như sau: mẫu bảo quản ở -200C ựược lấy ra và ựể ở nhiệt ựộ phòng cho tan. Nếu mẫu vật là mô cơ quan thì cần ựược nghiền kỹ rồi mới xử lý, nếu mẫu là nước trứng chứa virus dịch tả vịt ựã tiếp truyền (sử dụng trong nghiên cứu này của chúng tôi) thì trực tiếp xử lý với các dung môi của Kit, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết DNA theo qui trình tách chiết của hãng sản xuất như sau:
- Cho 20 l Proteinase K vào ống Eppendorf. Chạy Votex. - Thêm 200 l Buffer AL. Chạy Votex. ủ ở 560C trong 30 phút. - Thêm 200 l Ethanol (96- 100%), Votex, ly tâm 30 giâỵ
- Chuyển mẫu sang cột tách DNA, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch dướị
Ớ Thêm 500 l Buffer AW1, rồi ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới
Ớ Thêm 500 l Buffer AW2, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dướị Tiếp tục ly tâm thêm một lần nữa 13000 vòng/phút trong 1 phút ựể loại bỏ hết dịch rửạ
Ớ Chuyển cột lọc ựã giữ lại DNA hệ gen của virus trong màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5 ml. Thêm 200 l Buffer AE, ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 5 phút. Sau ựó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, ựó là DNA tổng số trong ựó có hệ gen DNA của virus dịch tả vịt. Ký hiệu mẫu, bảo quản ở -200C.
* Thiết kế và tổng hợp cặp mồi
Chúng tôi ựã sử dụng cặp mồi (primer) bám ựặc hiệu trên hệ gen DNA- polymerase của hệ gen virus dịch tả vịt theo quy ựịnh của OIE, 2012 như sau:
Mồi xuôi (DEV-7F): 5Ỗ- GAAGGCGGGTATGTAATGTA -3Ỗ. Mồi ngược (DEV-7R): 5Ỗ- CAAGGCTCTATTCGGTAATG -3Ỗ.
Cặp mồi này ựược tổng hợp dựa trên cơ sở trình tự cặp mồi ựã có của OIE, 2012 (http://www.oiẹint/) và trình tự gen của virus dịch tả vịt ựã công bố trên Ngân hàng gen (www.ncbịnlm.nih.gov). Cặp mồi này bám ựặc hiệu trên vùng gen DNA-polymerase của hệ gen của virus dịch tả vịt.
* Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR
Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng PCR
TT Thành phần Nồng ựộ Số lượng 1 Water 10,85 l 2 PCR buffer 10 x 2,50 l 3 MgCl2 25 mM 2,00 l 4 dNTP 2,5 mM 2,00 l 5 DEVR 10 picomol/l 2,50 l 6 DEVF 10 picomol/l 2,50 l
7 Taq DNA polymerase 5 u/l 0,15 l
8 Sợi mẹ (DNA) 2,50 l
Phản ứng PCR ựược thực hiện với chu trình nhiệt như sau:
TT Tên Nhiệt ựộ (0C) Thời gian (phút) Số vòng
1 Duỗi mạch 94 5 1 2 Duỗi mạch 94 1 40 3 Gắn mồi 50 1 4 Tổng hợp sợi mới 72 1 5 Hoàn chỉnh 72 10 1 6 Dừng 4
Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển về nhiệt ựộ 4oC bảo quản cho ựến khi tinh sạch sản phẩm. Sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR ựược bảo quản ở -20oC cho ựến khi sử dụng (ựể giải trình trình tự trực tiếp, hoặc nếu cần, tiến hành dòng hoá vào vectơ ựể giải trình trình tự).
* Phát hiện sản phẩm PCR
Chuẩn bị gel agarose 0,2%: Lấy 0,8g thạch agarose nguyên chất, cho vào cốc ựong thuỷ tinh chịu nhiệt, ựổ vào ựó 40ml ựệm TAE 1 lần (1xTAE). Cho vào lò vi sóng, ựặt nóng chảy trong 3 phút (hoặc 3 phút 30 giây) sao cho agarose tan chảy hết. đổ thạch ựã tan chảy vào hệ thống ựiện di, gài lược có nhiều răng vào (tuỳ theo cần bao nhiêu mẫu mà bố trắ lược có 4, 8 hay 12 răng) và ựổ ngập răng lược khoảng 0,5 cm và ựể nguội ở nhiệt ựộ phòng. Khi nguội (sau 60-120 phút), các răng lược sẽ tạo thành các giếng ựể cho mẫu sản phẩm PCR vào kiểm trạ
Dìm ngập khay có gel trong hộp ựiện di chứa ựệm TAE 1 lần (ựệm TAE cung cấp ion cho ựiện trường hoạt ựộng).
Tra mẫu: Lấy 10 l sản phẩm PCR mỗi loại, trộn với 2 l chất chỉ thị tra mẫu (loading dye 3X) (thành phần chủ yếu là xanh Bromophenol) với mẫu và tra riêng biệt vào từng giếng trong bản gel.
Tra chỉ thị phân tử (Marker): Trong 1 giếng riêng biệt khác cho 10l (0,5g) chỉ thị phân tử (thường dùng: DNA của thực khuẩn thể Lambda cắt bằng enzym giới hạn HindIII).
Chạy ựiện di ở 100V trong 30-35 phút.
Phát hiện DNA của sản phẩm: Nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide (2g/ml; 15 l/bản gel), lắc ựều trên máy lắc trong 10 phút.
Rửa gel bằng nước cất, sau ựó soi qua tia cực tắm và chụp ảnh, nhờ máy Dolphin-Doc (WEALTEC, USA).
Kắch thước các băng DNA ựược so sánh với chỉ thị di truyền DNA Marker